錳對大鼠丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響及PAS-Na的防護(hù)作用.pdf

1、目的：研究錳處理對原代培養(yǎng)大鼠丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷及谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）和甘氨酸（Gly）、γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酰胺酶（GS）活力的影響及對氨基水楊酸鈉(PAS-Na)的防護(hù)作用。
　　方法：（1）原代培養(yǎng)的丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過純化和鑒定后，①錳毒性試驗(yàn)，分別經(jīng)0、125、250、500、1000μmol/L MnCl2單獨(dú)作用6h、12h、24h和48h。②PAS-Na無毒性篩選試驗(yàn)，單獨(dú)給予0、50、

2、150、450和1350μmol/L PAS-Na單獨(dú)作用6h、12h、24h和48h，③PAS-Na干預(yù)劑量篩選實(shí)驗(yàn)，丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞被隨機(jī)分為正常對照組（對照組）、500Mn、500 Mn+50 PAS-Na、500Mn+150PAS-Na、500Mn+450PAS-Na和500Mn+1350PAS-Na干預(yù)組。對照組星形膠質(zhì)細(xì)胞用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)48h；染錳組、500Mn+50PAS-Na、500Mn+150PAS-Na、500Mn

3、+450PAS-Na和500Mn+1350PAS-Na干預(yù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞暴露于MnCl2500μmol/L培養(yǎng)液培養(yǎng)48h。隨后，吸出舊培養(yǎng)液，500 Mn+50PAS-Na、500 Mn+150PAS-Na、500Mn+450PAS-Na和500Mn+1350PAS-Na干預(yù)組分別用含PAS-Na50、150、450、1350μmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)6h、12h、24h和48h。用CCK8法和LDH測定試劑盒測定細(xì)胞存活率及乳酸脫氫酶

4、（LDH）漏出率。選擇合適的Mn處理及PAS-Na干預(yù)劑量和時(shí)間。
　　（2）用髙效液相色譜法(HPLC)和GS試劑盒測定原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞Glu、Gln、Gly、GABA含量和GS的活性。原代培養(yǎng)的丘腦星型膠質(zhì)細(xì)胞被隨機(jī)分為對照組、500Mn組、50PAS對照組、150PAS對照組、450PAS對照組、500Mn+50PAS組、500Mn+150PAS組、500Mn+450PAS組。對照組、50PAS對照組、150PAS對照

5、組、450PAS對照組細(xì)胞給予普通培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)；500Mn組、500Mn+50PAS組、500Mn+150PAS組、500Mn+450PAS組細(xì)胞暴露于MnCl2500μmol/L培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)。吸出舊培養(yǎng)液后。50PAS對照組、150PAS對照組、450PAS對照組、500Mn+50PAS組、500Mn+150PAS組、500Mn+450PAS組分別給予含 PAS-Na50、150和450μmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。其

6、余各組用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。
　　結(jié)果：（1）細(xì)胞存活率檢測結(jié)果顯示：①錳毒性試驗(yàn)中，與對照組比較，除了125μmol/L MnCl2處理6h組，其他組丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率下降，有一定的時(shí)間和劑量反應(yīng)趨勢（P<0.05）；②在PAS-Na無毒濃度篩選實(shí)驗(yàn)中，與對照組比較，1350μmol/L PAS-Na處理48h組丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率降低（P<0.05）；其他各劑量處理組在不同時(shí)間的細(xì)胞存活率無明顯變化（P>0.05）。

7、③PAS-Na干預(yù)劑量篩選實(shí)驗(yàn)中，與對照組比較，500μmol/L MnC12組星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率降低（P<0.05）；50、150、450μmol/L PAS-Na干預(yù)24h和48h后,星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率均顯著升高（P<0.05），但無時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。（2）細(xì)胞LDH漏出率結(jié)果顯示：①錳毒性試驗(yàn)中，與對照組比較,250、500和1000μmol/L MnCl224h處理組和125～1000μmol/L MnCl248h處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞

8、LDH漏出率升高，具有一定的時(shí)間/劑量反應(yīng)關(guān)系（P<0.05）；②在PAS-Na無毒濃度篩選實(shí)驗(yàn)中，PAS-Na單獨(dú)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞48小時(shí)后，1350μmol/L組星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH漏出率升高（P<0.05）；其他各劑量處理組在不同時(shí)間的細(xì)胞LDH漏出率無明顯改變（P>0.05）。③PAS-Na干預(yù)劑量篩選實(shí)驗(yàn)中，與對照組比較，500μmol/L MnCl2組LDH漏出率明顯升高（P<0.05）；150、450、1350μmol/L

9、 PAS-Na干預(yù)24h和50、150、450、1350μmol/L PAS-Na干預(yù)48小時(shí)使細(xì)胞 LDH漏出率降低(P<0.05)。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們選擇500μmol/L MnCl2和48h作為錳處理的劑量和時(shí)間。同時(shí)，我們選擇50、150、450μmol/L PAS-Na干預(yù)24h,作為干預(yù)劑量和時(shí)間。（3）HPLC和GS試劑盒結(jié)果顯示：與對照組比較，染錳（500
　　μmol/L）48小時(shí)組丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Gln和G

10、ABA含量降低，GS活性降低，Glu和Gly含量升高(P<0.05)；500Mn組丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞外液Glu和Gly含量比對照組高，Gln含量比對照組高(P<0.05)，而GABA含量沒有顯著變化（P>0.05）；與500Mn組比較，500Mn+450PAS組細(xì)胞內(nèi)和500Mn+50PAS、500Mn+150PAS細(xì)胞外Glu含量降低，500Mn+450PAS組細(xì)胞內(nèi)和500Mn+50PAS、500Mn+150PAS、500Mn+450

11、PAS組細(xì)胞外Gln含量升高，500Mn+150PAS、500Mn+450 PAS組細(xì)胞內(nèi)Gly降低，500Mn+150PAS、500Mn+450 PAS組細(xì)胞內(nèi)GABA含量升高(P<0.05)。500Mn組GS活性比對照組低；與500Mn組比較，500Mn+450 PAS組GS活性升高。
　　結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)中，錳處理會對原代培養(yǎng)的大鼠丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致Glu、Gln、Gly、GABA及GS活性異常改變。PAS-Na對