極大節(jié)旋藻生物鐘基因的克隆和表達分析.pdf

1、生物鐘是生物體隨外界環(huán)境做周期性變化的一種現(xiàn)象，而生物鐘節(jié)律則源于生物體內(nèi)的生物鐘基因。藍藻作為最早報道具有生物鐘節(jié)律的原核生物受到了人們的重視，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)藍藻生物鐘調(diào)控著許多代謝途徑和基因的表達，生物鐘的調(diào)控作用是藍藻自身調(diào)控的一種重要機制。節(jié)旋藻(Arthrospria)因其重要的經(jīng)濟價值和特殊的生物學(xué)性質(zhì)而受到廣泛關(guān)注，但節(jié)旋藻生物鐘基因方面的研究尚屬空白，對節(jié)旋藻的生物鐘節(jié)律更是缺乏了解。 本研究通過構(gòu)建PCR反

2、應(yīng)池的方法對節(jié)旋藻基因組DNA的fosmid文庫進行篩選得到含kai基因簇的陽性克隆4個。測序得到3820bp的DNA片段，其中含有完整的kai基因簇。分析發(fā)現(xiàn)節(jié)旋藻的kai基因簇由kaiA、kaiB、kaiC三個基因組成，kaiA、kaiB、kaiC基因的編碼區(qū)(Open Reading frame，ORF)，長度分別為858bp、315bp、1554bp，它們在基因組中以ABC的順序依次排列構(gòu)成節(jié)旋藻的kai基因簇。kaiA、kai

3、B、kaiC基因ORF的GC堿基含量基本持平，分別為39.86％、39.37％、41.76％。密碼子分析發(fā)現(xiàn)，kai基因簇密碼子第三位偏向于堿基U，其中kaiC基因密碼子的偏向性最為明顯。啟動子分析發(fā)現(xiàn)在kaiA、kaiB基因編碼區(qū)前發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的啟動子序列，kaiB與kaiC間隔區(qū)也發(fā)現(xiàn)了一個可能的啟動子序列，對發(fā)現(xiàn)的啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)了GATA盒。對Kai蛋白分析發(fā)現(xiàn)，KaiA蛋白含有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、酪氨酸

4、激酶磷酸化位點，二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)有14個α螺旋、6個β折疊，并與PDB數(shù)據(jù)庫中Thermosynechococcus elongatus bp-1的KaiA蛋白的折疊方式相似，結(jié)構(gòu)一致性為64.5％。KaiB蛋白含有N端?；稽c、蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)有5個α螺旋、5個β折疊，與PDB數(shù)據(jù)庫中魚腥藻PCC 7120的KaiB蛋白的折疊方式相近，結(jié)構(gòu)一致性為96.7％。 KaiC蛋白中不僅

5、發(fā)現(xiàn)N端?；稽c、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點、N端糖基化位點，而且還發(fā)現(xiàn)了一些具有重要的功能的模體walker A、DXXG等，二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)有18個α螺旋、22個β折疊，與PDB數(shù)據(jù)庫中聚球藻PCC 7942的KaiC蛋白的折疊方式相近，結(jié)構(gòu)一致性為81.6％。蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹分析發(fā)現(xiàn)，Kai蛋白都比較保守，其中KaiC蛋白的保守性最高，KaiA蛋白的保守性最低。本研究還

6、對已知的kai基因簇設(shè)計探針，Southem雜交分別測定了kai基因在節(jié)旋藻基因組內(nèi)的拷貝數(shù)。雜交結(jié)果顯示kaiA、kaiB、kaiC基因均為單拷貝，證明極大節(jié)旋藻FACHB 438只含有kai基因簇，而不含游離于基因簇外的kai基因，間接證明kai基因是有功能的。 本研究還對92小時不同培養(yǎng)條件下的極大節(jié)旋藻的kai基因簇表達進行檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在持續(xù)光照條件下，節(jié)旋藻kai基因簇表達具有明顯的12小時的節(jié)律，而在對照組(1