家蠶生物鐘基因Bm-cry的克隆及滯育誘發(fā)環(huán)境對(duì)其表達(dá)的影響.pdf

1、近日節(jié)律是生物界最普遍的節(jié)律行為，光節(jié)律和溫度是影響近日節(jié)律基因表達(dá)的重要授時(shí)因子，但溫度的誘導(dǎo)機(jī)制研究目前只集中在果蠅等少數(shù)昆蟲。cryptochrome(cry)是已確認(rèn)的主要鐘基因之一，其編碼的蛋白隱色素(Cryptochrome，CRY)是調(diào)節(jié)生物體晝夜生物鐘導(dǎo)引過程的光感受器，在果蠅中是核心時(shí)鐘的組成元件，核心時(shí)鐘光照和溫度誘導(dǎo)途徑中都需要CRY蛋白的參與。昆蟲cry基因具有cry1和cly2兩類，果蠅只有cry1，蜜蜂等膜翅

2、目昆蟲只有cry2。家蠶是鱗翅目模式昆蟲，也是唯一完成了全基因組測序的鱗翅目昆蟲，可能同時(shí)具有cry1和cry2基因。研究家蠶的cry基因，有可能了解cry1和cry2基因的功能差異和相互作用。家蠶是產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲，滯育是家蠶等昆蟲的基本生理現(xiàn)象，是影響蠶業(yè)生產(chǎn)和害蟲防治的重要性狀。家蠶滯育卵的誘導(dǎo)發(fā)生決定于親代卵孵化時(shí)期的溫度和光照。在家蠶滯育卵誘導(dǎo)條件下，研究cry基因的作用，對(duì)進(jìn)一步探明家蠶滯育的生物鐘分子機(jī)制，具有重大

3、的理論價(jià)值和實(shí)際意義。 本文利用生物信息學(xué)和RACE等方法，克隆了家蠶2個(gè)cry同源基因Bm-cry1和Bm-cry2的完整開放讀碼框(ORF)，對(duì)其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和分子進(jìn)化分析；進(jìn)一步以親代卵孵化期滯育誘導(dǎo)發(fā)生溫度和光節(jié)律條件處理，用RT-PCR等方法調(diào)查了親代卵和次代卵、以及幼蟲不同組織中Bm-cry2基因的表達(dá)譜，從滯育調(diào)控角度研究了近日節(jié)律基因cry的作用機(jī)制。 主要獲得以下結(jié)果： Bm-cry

4、1基因ORF框全長1578bp，編碼525個(gè)氨基酸，包含12個(gè)外顯子，11個(gè)內(nèi)含子；Bm-cry2基因ORF全長2193bp，編碼730個(gè)氨基酸，包含9個(gè)外顯子，8個(gè)內(nèi)含子。蛋白序列分析表明，Bm-CRY1分子量60241.96，等電點(diǎn)6.01。Bm-CRY2分子量83609.91，等電點(diǎn)8.93。Bm-CRY1和Bm-CRY2均無明顯信號(hào)肽序列，屬于非分泌蛋白。兩者都含有N-糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、

5、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、N-十四?；稽c(diǎn)，但是Bm-CRY2還含有cAMP和cGMP依賴型蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)和細(xì)胞附著特征序列。 蛋白同源性分析結(jié)果表明，Bm-CRY1在不同物種中的保守性較高，Bm-CRY2的保守區(qū)高度一致，但C端保守性較低，Bm-cry2ORF的3’端編碼的一部分區(qū)域可能是隱色素C端的可變區(qū)。Bm-cry1和Bm-cry2都具有DNA光解酶和FAD結(jié)合區(qū)兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，表明這2個(gè)基因是光解酶/隱色

6、素超基因家族成員。分子進(jìn)化分析表明，Bm-cry1和Bm-cry2與柞蠶(Antheraeapernyi)等鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲的親緣關(guān)系最近，與脊椎動(dòng)物(vertebrate)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與傳統(tǒng)理論的進(jìn)化關(guān)系一致；果蠅(Drosophila)等雙翅目(Diptera)昆蟲只有cry1，蜜蜂(Apismellifera)等膜翅目(Hymenoptera)昆蟲只有cry2，鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲的晝夜生物

7、鐘運(yùn)行機(jī)制依賴于cry1與cry2基因的共同存在，可能同時(shí)體現(xiàn)雙翅目昆蟲和膜翅目昆蟲晝夜生物鐘調(diào)控的特點(diǎn)。 家蠶在孵化期25LL(25℃持續(xù)光照)滯育卵完全誘發(fā)條件下，Bm-cry2基因表達(dá)量顯著低于15DD(15℃持續(xù)黑暗)非滯育卵完全誘發(fā)條件，也低于20LD(20℃、LD=12h:12h)滯育卵和非滯育卵同時(shí)誘發(fā)條件。20LD和15DD條件相比，孵化前中期(積溫360-1880℃·h)15DD條件下的Bm-cry2基因表達(dá)水

8、平總體高于20LD，但在中后期(積溫2160-3600℃·h)相反。進(jìn)一步調(diào)查家蠶胚胎對(duì)環(huán)境敏感時(shí)期(7d-9d)Bm-cry2基因的表達(dá)節(jié)律，結(jié)果表明25LL條件下，Bm-cry2表達(dá)量基本以24h為周期波動(dòng)，但峰谷值差異較?。?0LD條件下，Bm-cry2的表達(dá)量以42h為近似周期波動(dòng)，峰谷值差異顯著；15DD條件下，Bm-cry2的表達(dá)量以96h為近似周期波動(dòng)，峰谷值差異也很顯著。提示低溫和短光照的孵化條件會(huì)改變Bm-cry2的表

9、達(dá)節(jié)律，使近日節(jié)律基因Bm-cry2的相位延遲。溫度越低、光照時(shí)間越短，蠶卵Bm-cry2表達(dá)周期波動(dòng)所需的孵化積溫越高。 家蠶親代卵25℃持續(xù)光照孵化條件下，所產(chǎn)子代卵具有滯育性。產(chǎn)卵后20h，通過鹽酸活化處理，胚胎活化和發(fā)育過程中Bm-cr2基因的轉(zhuǎn)錄活性高于同時(shí)期的非浸酸卵。親代不同溫度(25℃、15℃)孵化處理結(jié)果表明，25℃條件下次代卵在進(jìn)入滯育期時(shí)，Bm-cry2的轉(zhuǎn)錄水平也隨之降低；而親代不同光照(LL，DD)孵化