人支氣管上皮細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子合成及葛根素的抑制作用.pdf

1、目的：⑴構(gòu)建支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)和嗜中性粒細(xì)胞(Neutrophils細(xì)胞)接觸共培養(yǎng)體系。⑵給予共培養(yǎng)體系不同劑量葛根素進(jìn)行干預(yù),探討其對炎性細(xì)胞因子的影響。⑶探討不同劑量葛根素對共培養(yǎng)體系NF-κB、p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　 方法：①采用免疫磁珠法分離純化人外周血Neutrophils細(xì)胞,與BEAS-2B細(xì)胞接觸培養(yǎng)構(gòu)建共培養(yǎng)體系。②隨機(jī)分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組:BEAS-2B單獨(dú)培養(yǎng)組(BEAS-2

2、B組),Neutrophils細(xì)胞(Neutrophils組),BEAS-2B細(xì)胞和Neutrophils細(xì)胞接觸共培養(yǎng)～(BEAS-2B+Neutrophils組),50μg/ml葛根素干預(yù)BEAS-2B細(xì)胞和Neutrophils細(xì)胞共培養(yǎng)組(BEAS-2B+Neutrophils+PUE50組),100μg/ml葛根素干預(yù)BEAS-2B細(xì)胞和Neutrophils細(xì)胞共培養(yǎng)組(BEAS-2B+Neutrophils+PUE100組

3、),200μg/ml葛根素干預(yù)BEAS-2B細(xì)胞和共培養(yǎng)組(BEAS-2B+Neutrophils+PUE200組)。③應(yīng)用蛋白芯片篩查BEAS-2B細(xì)胞和Neutrophils細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、聯(lián)合培養(yǎng)、加葛根素干預(yù)培養(yǎng)體系12h后細(xì)胞因子表達(dá)差異；應(yīng)用ELISA方法定量測定上述不同培養(yǎng)體系于培養(yǎng)第2h、6h、12h、18h炎性細(xì)胞因子濃度；應(yīng)用Real-time PCR方法檢測上述不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)12h后BEAS-2B細(xì)胞和Neutro

4、phils細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)；應(yīng)用Western blot方法對上述不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)單獨(dú)或接觸共培養(yǎng)30min后BEAS-2B細(xì)胞和Neutrophils細(xì)胞中的Phospho-IκBα、IκB-α、Phospho—p38、p38蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：⑴BEAS-2B組及Neutrophils組在單獨(dú)培養(yǎng)條件下,有少量的IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2分泌；BEAS

5、-2B細(xì)胞和Neutrophils細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2濃度升高。BEAS-2B+Neutrophils組與BEAS-2B組和Neutrophils組之和相比較,IL-6、IL-8、MCP-1、MIP—1α、MIP-1β、TIMP-2濃度明顯增加(p<0.05)。給予不同濃度葛根素對聯(lián)合培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞和Neutrophils細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后,BEAS-2B+N

6、eutrophils+PUE50組、BEAS-2B+Neutrophils+PUE100組、BEAS-2B+Neutrophils+PUE200組分泌的IL-6、IL-8、MCP-1、MIP—1α、MIP-1β、TIMP-2濃度有不同程度下降(與BEAS-2B+Neutrophils組比較,p<均<0.01)。⑵聯(lián)合培養(yǎng)后BEAS-2B細(xì)胞中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2基因表達(dá)水平明顯上調(diào),而

7、經(jīng)葛根素干預(yù)可顯著抑制兩種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)上述炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)。⑶于Neutrophils共培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞較單獨(dú)培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞,其Phospho-IκB和Phospho-p38蛋白表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。對共培養(yǎng)體系應(yīng)用不同濃度的葛根素進(jìn)行干預(yù),BEAS-2B細(xì)胞與共培養(yǎng)體系中未經(jīng)葛根素干預(yù)的BEAS-2B細(xì)胞相比,Phospho-IκB和Phospho-p38蛋白表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義(p<0.01)。應(yīng)用葛根素干預(yù)的共培養(yǎng)體系中的Neutrophils細(xì)胞較未經(jīng)葛根素干預(yù)的Neutrophils細(xì)胞Phospho-IκB和Phospho-p38蛋白表達(dá)明顯降低(p<0.01)。
　　 結(jié)論：①Neutrophils細(xì)胞與BEAS-2B細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)可上調(diào)BEAS-2B細(xì)胞中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2基因表達(dá)和顯著增加細(xì)胞培養(yǎng)上清液中上述炎性細(xì)胞因子濃度；②葛根