大蒜素對(duì)高糖環(huán)境人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和凋亡的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病腎病是糖尿病常見和嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年研究表明，腎小管間質(zhì)病變是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，進(jìn)一步深入研究腎小管間質(zhì)病變的分子機(jī)制、尋找有效治療的新靶點(diǎn)，對(duì)預(yù)防和延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展有重要意義。
　　 腎小管間質(zhì)纖維化的過(guò)程包括腎小管的萎縮和消失、肌成纖維細(xì)胞的聚積和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。目前認(rèn)為腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)主要由

2、肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，但有證據(jù)表明，在一些病理?xiàng)l件下，腎小管上皮細(xì)胞可發(fā)生上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，即腎小管上皮細(xì)胞喪失原有的上皮細(xì)胞表型特征，獲得肌成纖維細(xì)胞的表型，大量表達(dá)肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白。已有眾多的研究表明，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化直接參與腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的的中心環(huán)節(jié)，已成為腎纖維化乃至慢性腎功能衰竭的重要機(jī)制之一。
　　 細(xì)胞凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡是多細(xì)胞生物維系

3、結(jié)構(gòu)完整和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本生物學(xué)特性。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其與疾病關(guān)系的深入研究，表明細(xì)胞凋亡密切參與了糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病早期即出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，后者是導(dǎo)致腎小管功能障礙的重要原因之一，也是糖尿病腎病進(jìn)展為慢性腎功能衰竭的重要機(jī)制之一。有研究顯示，腎小管間質(zhì)纖維化形成中存在明顯的腎小管上皮細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，病變?cè)缙诘蛲黾?xì)胞數(shù)隨著腎間質(zhì)纖維化的加重呈明顯增高趨勢(shì)。因此在糖尿病腎病致腎小管間質(zhì)纖

4、維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腎小管上皮細(xì)胞凋亡是高血糖損傷腎小管上皮細(xì)胞的重要病理變化形式之一。
　　 大蒜素，是大蒜的主要有效成分。現(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大蒜素具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、提高機(jī)體免疫力等多方面的作用。近年研究表明，大蒜素有抗肺、肝及心肌纖維化作用，主要與其抑制成纖維細(xì)胞增殖，抑制促纖維化因子的分泌及減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成等有關(guān)。
　　 研究目的：
　　 1.觀察大蒜素對(duì)高糖環(huán)境下人近端

5、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用，并初步探討大蒜素抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制。
　　 2.觀察大蒜素對(duì)高糖環(huán)境下人近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，并初步探討大蒜素抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.以人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2細(xì)胞為研究對(duì)象，按實(shí)驗(yàn)條件分為4組，以DMEM為培養(yǎng)基，即正常糖對(duì)照組、高糖組、大蒜素組和ERK抑制劑組，分別培養(yǎng)24h、48h。采用免

6、疫細(xì)胞化學(xué)法、熒光免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)α-SMA、Vimentin和Collagen I的相對(duì)表達(dá)量，Real-time PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)TGF-β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)，Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞TGF-β1、p-ERKl/2蛋白的相對(duì)表達(dá)。
　　 2.以人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2細(xì)胞為研究對(duì)象，按實(shí)驗(yàn)條件分為3組，以DMEM為培養(yǎng)基，即正常糖對(duì)照組、高糖組和大蒜素組，細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h。采用流式

7、細(xì)胞術(shù)觀察各組細(xì)胞的凋亡率，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HK-2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　 3.應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用率（％）表示，各組間比較采用x?檢驗(yàn)，p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.大蒜素對(duì)HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響
　　 正常糖對(duì)照組生長(zhǎng)24h后，形成融合的單層細(xì)胞，呈橢

8、圓形或者多邊形貼壁細(xì)胞，生長(zhǎng)48h后細(xì)胞間緊密連接，具有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)學(xué)特征。高糖組生長(zhǎng)24h后，細(xì)胞形態(tài)改變不明顯，生長(zhǎng)48h后，可見部分細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣外觀：細(xì)胞拉長(zhǎng)、肥大，呈長(zhǎng)梭形，由橢圓形貼壁生長(zhǎng)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，喪失其鋪路石樣生長(zhǎng)方式。大蒜素組干預(yù)48小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)與N組無(wú)明顯差異，光鏡下多數(shù)細(xì)胞保持正常上皮，僅少數(shù)發(fā)生形態(tài)變化。PD98059組細(xì)胞生長(zhǎng)48h后，受高糖刺激而出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)改變

9、有一定程度的改善。
　　 2.大蒜素對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA、Vimentin、Collagen I表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞培養(yǎng)48h，高糖組α-SMA、Vimentin、Collagen I表達(dá)的積分光密度值較正常糖對(duì)照組明顯增加，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PD98059組α-SMA、Vimentin和Collagen I表達(dá)的IOD較高糖組均明顯減少，且與正常糖對(duì)照組無(wú)明顯差異；高糖環(huán)境下經(jīng)不同濃度的大蒜素干預(yù)后，α-SMA、V

10、imentin、Collagen I表達(dá)的IOD明顯下降，并呈濃度依賴性，尤以20ug/mL更為明顯，此組與正常糖對(duì)照組和PD98059組比較無(wú)顯著差別。
　　 3.大蒜素對(duì)HK-2細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞培養(yǎng)48h時(shí)，與正常糖對(duì)照組比較，高糖組HK-2細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào); PD98059組可逆轉(zhuǎn)高糖刺激下的TGF-β1 mRNA表達(dá)，但仍高于正常糖對(duì)照組；大蒜素可明顯下調(diào)高糖

11、刺激下HK-2細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)，并呈濃度依賴效應(yīng)，尤其在10ug/ml、20ug/ml時(shí)，同時(shí)與PD98059組比較無(wú)顯著性差異，且20ug/ml時(shí)與正常糖對(duì)照組比較亦無(wú)顯著性差異。
　　 4.大蒜素對(duì)HK-2細(xì)胞TGF-βl、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞培養(yǎng)48h時(shí)，正常糖對(duì)照組HK-2細(xì)胞可見少量TGF-β1、p-ERK l/2蛋白的表達(dá)；高糖組HK-2細(xì)胞TGF-β1、p-ERK l/2

12、的蛋白表達(dá)較正常糖對(duì)照組明顯上調(diào)；與高糖組比較，PD98059組TGF-β1、p-ERK l/2蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，而TGF-β1蛋白與正常糖對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異；與高糖組比較，經(jīng)不同濃度大蒜素干預(yù)48小時(shí)后，HK-2細(xì)胞TGF-β1、p-ERKl/2蛋白的表達(dá)水平均呈藥物濃度依賴性下調(diào)，尤以20ug/mL濃度作用最強(qiáng)，抑制率分別為55.7％和37.7％，且與正常糖對(duì)照組比較，p-ERK l/2蛋白表達(dá)亦明顯下調(diào)，而TGF-β1蛋白表

13、達(dá)差異無(wú)顯著性，但兩者均仍高于PD98059組。
　　 5.大蒜素對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡率的影響
　　 細(xì)胞培養(yǎng)24h，正常糖對(duì)照組只有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡率僅為（6.56±1.09）％，而高糖組凋亡率為（16.25±0.58）％，兩組間有顯著性差異；大蒜素干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率分別為（12.54±2.21）％、（9.21±2.85）％、（8.53±2.15）％、（6.81±0.92）％，均較高糖組有明顯下降，且大蒜素濃度為5

14、、10、20ug/ml時(shí)與正常糖對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。細(xì)胞培養(yǎng)48h，正常糖對(duì)照組細(xì)胞亦只有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡率僅為（6.82±2.38）％，高糖組升高為（23.53±3.21）％；而大蒜素干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率分別為（14.43+1.85）％、（11.68±3.20）％、（10.19±1.93）％、（7.99±2.00）％，與高糖組比較均有明顯下降，且大蒜素濃度為10、20ug/mL時(shí)與正常糖對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。
　　

15、6.大蒜素對(duì)HK-2細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞培養(yǎng)48h，高糖組Bcl-2蛋白表達(dá)的積分光密度值為（14.08±2.14），較正常糖對(duì)照組的IOD（31.97±4.29）明顯降低，不同濃度的大蒜素組的Bcl-2蛋白表達(dá)的IOD高于高糖組，并隨著濃度的增高而升高，但仍低于正常糖對(duì)照組；而Bax蛋白則正好相反，高糖組Bax蛋白表達(dá)的IOD為（109.83±14.13），較正常糖對(duì)照組的IOD（29.68±3.3

16、0）明顯升高，不同濃度大蒜素組的Bax蛋白表達(dá)的IOD明顯低于高糖組，并隨著濃度的增高而逐漸降低，但仍高于正常糖對(duì)照組。Bcl-2/Bax的比值在高糖組明顯低于正常糖對(duì)照組，經(jīng)大蒜素干預(yù)后其比值較高糖組有升高，并呈濃度依賴性，但仍明顯低于正常糖對(duì)照組（p<0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 1.高糖可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，上調(diào)TGF-β1和細(xì)胞外基質(zhì)成分Collagen I的表達(dá)。
　　 2.ERK

17、l/2信號(hào)通路抑制劑PD98059可明顯抑制高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)分化，下調(diào)TGF-β1和Collagen I的表達(dá)，阻斷ERK l/2信號(hào)通路是抑制TEMT、防治腎間質(zhì)纖維化的重要干預(yù)靶點(diǎn)。
　　 3.大蒜素可通過(guò)抑制ERK l/2信號(hào)通路的激活而抑制高糖狀態(tài)下HK-2細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，下調(diào)TGF-β1和Collagen I的表達(dá)，其抑制作用與PD98059相似。
　　 4.高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋