十字花科黑腐病菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應物基因的篩選和鑒定.pdf

1、十字花科黑腐病(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)是一種能在全球范圍內引起所有十字花科植物黑腐病的重要病原細菌。在革蘭氏陰性細菌中，存在六種主要的蛋白分泌系統(tǒng)參與大分子物質的分泌。其中Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)對多種的動物及人體病原細菌的致病性起著重要的作用，而且在植物病原細菌根癌農桿菌的致病過程中扮演重要角色。在黃單胞菌屬中，Xac有12個基因編碼的蛋白與VirD4(Ⅳ型分泌系統(tǒng)ATPase)

2、互作?；蚪M注釋表明，Xcc8004含有編碼T4SS的基因，其中10個基因(XC1630-XC1639)成簇存在。而且XC1630-XC1639的Tn5gusA5突變體的GUS活性平板檢測顯示，這10個基因在MMX培養(yǎng)基上明顯比在NYGA培養(yǎng)基上表達強烈，表明T4SS是受信號誘導的。本研究旨在篩選和鑒定Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應物，為闡明該系統(tǒng)的生理功能，作用機制奠定基礎。
　　 首先以三個Xcc8004Ⅳ型分泌系統(tǒng)裝置蛋白基因XC163

3、2、XC1633和XC1637的Tn5gusA5突變體為報告系統(tǒng)，通過測定GUS的方法，檢測了常用的六種培養(yǎng)基，結果顯示XCM誘導效果最好。然后以XCM為基礎，用多種常用碳源，氨基酸和TCA循環(huán)成分替換琥珀酸，結果沒有發(fā)現(xiàn)更好的替代物。在XCM不同pH條件下進行GUS活性檢測，顯示pH7.0較好。此外，能誘導農桿菌Vir基因活化的乙酰丁香酮經(jīng)檢測對Xcc的T4SS無誘導效果。因此選定了XCMpH7.0作為誘導T4SS的培養(yǎng)基。
　

4、　 其次在Xcc8004里搜尋與Xac的12個基因同源的基因，并從中挑選了4個：XC0066、XC2288、XC3660和XC4282作為研究對象。通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)這4個基因編碼的蛋白C端含有與Xac里報道相似的保守序列（GLxRIDHV和GxxDPAHxRAHV，x為任意殘基），而且也都存在富含谷氨酰胺的尾巴。PCR擴增目標基因啟動子加ORF去掉終止密碼子片段，克隆到報告質粒pLGUS上，將獲得的重組質粒三親分別導入到Xcc