十字花科黑腐病菌中十個小RNA的功能鑒定.pdf

1、細菌小RNA，也叫非編碼RNA，是一類大小處于50～500 nt之間的RNA分子。細菌小RNA可以獨立地行使一些特定的功能，但是不具備編碼蛋白的能力，與核糖體RNA和轉(zhuǎn)運RNA有明顯的差異。小RNA廣泛存在于各種生物中，對細胞的生理過程起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，它們作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在細菌的糖代謝、碳源代謝、群體感應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、細胞運動和致病性等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前，小RNA的鑒定工作以及對其功能進行研究是當(dāng)前微生物學(xué)研究

2、領(lǐng)域的前沿和熱點。目前，有效鑒定小RNA方法已經(jīng)成功建立，已經(jīng)成功鑒定了近1000個細菌小RNA，但是它們的生物學(xué)功能幾乎沒有被確定。小RNA在植物病原細菌致病過程中的作用和重要性仍然需要更深入的研究。
　　十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathovar campestris下文簡稱為Xcc）是引起十字花科植物黑腐病的病原菌，它是研究病原菌與植物相互作用領(lǐng)域的一個極其重要的模式菌株。近來，本課題組

3、采用RNA深度測序(RNA-seq)方法，對Xcc8004菌株在MMX基本培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期時表達的小RNA進行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了500多個候選。但是這些候選小RNA的生物學(xué)功能仍不清楚。本研究選取了十個候選小RNA作為研究對象，首先采用三引物RT-PCR法確證它們的存在，然后分別構(gòu)建這十個候選小RNA的缺失突變體和過量表達株，然后對構(gòu)建成功的缺失突變體和過量表達株的相應(yīng)表型均進行檢測和分析討論從而得知它們具有怎么的生物學(xué)功能。

4、>　　三引物RT-PCR結(jié)果分析得知這十個候選小RNA的確是真實存在的。然后，通過鏈特異性RT-PCR的方法，我們可以進一步得知這十個小RNA的主要轉(zhuǎn)錄方向。目前，本研究已成功構(gòu)建了這10個目的小RNA的9個缺失突變體和10個過量表達菌株，然后，對成功構(gòu)建的所有缺失突變體和過量表達株均進行了一系列的表型檢測，分別為:(1)在豐富培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基內(nèi)的生長情況、(2)胞外多糖產(chǎn)量和胞外酶活性、(3)游動性、(4)生物膜形成、(5)在非寄主

5、植物上引起的高敏反應(yīng)（HR反應(yīng)）、(6)在寄主植物上的致病能力等表型進行了檢測，然后把檢測的所有表型與野生型菌株和帶有空的過量表達載體pBBad18K的野生型菌株的表型作出了相應(yīng)的比較和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)小RNA sRXcc-50的缺失突變體DM50在豐富培養(yǎng)基中的生長穩(wěn)定期的菌體密度小于野生型菌株;(2)小RNAsRXcc-49、sRXcc-51、sRXcc-52、sRXcc-55的缺失突變體DM49、DM51、DM52、DM55

6、在基本培養(yǎng)基中的對數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體密度明顯小于野生型菌株;(3)小RNA sRXcc-53的過量表達株OE53在基本培養(yǎng)基中的對數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體密度明顯低于對照組WT/pBBad18K;(4)小RNA sRXcc-55的過量表達株OE55在基本培養(yǎng)基中的對數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體密度明顯高于對照組WT/pBBad18K;(5)小RNA sRXcc-49的缺失突變體DM49在辣椒葉片上出現(xiàn)HR反應(yīng)的時間比野生型Xcc8004早;(6)小RN

7、A sRXCC-52、sRXCC-55、sRXCC-56的過量表達株OE52、OE55、ROE56在辣椒葉片上出現(xiàn)HR反應(yīng)的時間比對照組WT/pBBad18K早;(7)其它的缺失突變體和過量表達株的所有表型檢測結(jié)果幾乎與對照菌株的完全一樣。
　　檢測結(jié)果表明:(1)小RNA sRXcc-49、sRXcc-50、sRXcc-51、sRXcc-52、sRXcc-53、sRXcc-55與Xcc的生長有關(guān);(2)小RNA sRXcc-49

8、、sRXcc-52、sRXcc-55、sRXcc-56在Xcc8004的過敏反應(yīng)中可能起著重要的調(diào)控作用。
　　綜上所述，本工作驗證了十個Xcc候選小RNA的存在，確定了它們的轉(zhuǎn)錄方向，并對它們的生物學(xué)功能進行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了六個小RNA(sRXcc-49、sRXcc-50、sRXcc-51、sRXcc-52、sRXcc-53、sRXcc-55)與生長有關(guān)，四個（sRXcc-49、sRXcc-52、 sRXcc-55、sRXcc