十字花科黑腐病菌中表達(dá)受酸堿影響的十個(gè)小RNA的鑒定和功能研究.pdf

1、細(xì)菌小 RNA（small RNAs,sRNAs),也稱為非編碼 RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)和調(diào)控RNA(Regulatory RNA),是一類大小通常在50~500 nt之間,不編碼蛋白,但是具有獨(dú)立功能的RNA分子。研究表明,細(xì)菌小RNA參與了細(xì)胞糖代謝、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)、群體感應(yīng)、致病、以及包括對(duì)酸堿等環(huán)境脅迫應(yīng)答等多方面的細(xì)胞生理過程。最近十幾年來,由于有效鑒定小RNA方法的建立,越來越多的細(xì)菌小RNA被

2、鑒定,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上千個(gè)細(xì)菌小RNA,但只有少數(shù)細(xì)菌小RNA的生物學(xué)功能被確定。
　　十字花科黑腐病菌,也叫野油菜黃單胞菌致病變種(Xanthomonas campestris pv.campertris,Xcc)是引起十字花科植物(其中包括重要的蔬菜如蘿卜、白菜、甘藍(lán)及重要的油料作物油菜等)發(fā)生黑腐病的病原菌。為了尋找Xcc中參與酸堿脅迫應(yīng)答的小 RNA,本實(shí)驗(yàn)室之前通過采用高通量深度測序方法,初步鑒定了500多個(gè)表達(dá)受酸堿影

3、響的候選小RNA,但這些候選小RNA是否真正存在、表達(dá)是否真的受酸堿影響、以及它們的生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步研究。在本研究中,我們從中選取了十個(gè)候選小RNA(重新命名為 sRXCC-25到sRXCC-34)作為研究對(duì)象,首先采用三引物RT-PCR法證實(shí)它們的存在,然后用半定量RT-PCR方法確定它們的表達(dá)是否受受酸堿影響,最后通過構(gòu)建它們的過量表達(dá)株和缺失突變體并進(jìn)行表型分析來確定它們的生物學(xué)功能。
　　三引物RT-PCR結(jié)果證明這

4、十個(gè)小RNA是真實(shí)存在的。接著我們還用鏈特異 PCR方法確定了它們的轉(zhuǎn)錄方向。半定量 RT-PCR結(jié)果顯示,所有十個(gè)目的小RNA的表達(dá)均受到酸影響,其中五個(gè)小RNA(sRXCC-26至sRXCC-30)的表達(dá)同時(shí)還受到堿的影響。到目前為止,我們已經(jīng)獲得了所有十個(gè)目的小RNA(sRXCC-25到sRXCC-34)的過量表達(dá)株(分別命名為OE25到OE34),以及六個(gè)小RNA(sRXCC-25、sRXCC-29、sRXCC-30、sRXCC

5、-31、sRXCC-33和sRXCC-34)的缺失突變體(分別命名為DM25、DM29、DM30、DM31、DM33和DM34)。我們對(duì)所構(gòu)建的所有缺失突變體和過量表達(dá)株的以下表型:(1)對(duì)酸堿的耐受能力、(2)胞外多糖產(chǎn)量和胞外酶活性、(3)對(duì)SDS和NaCl的耐受力、(4)對(duì)重金屬的耐受能力、(5)游動(dòng)能力、(6)生物膜形成、(7)生長、(8)在寄主植物上的致病力、以及(9)在非寄主植物上引起高敏反應(yīng)(HR反應(yīng))能力等表型進(jìn)行了檢測

6、,并和野生型菌株和帶有空的過量表達(dá)載體 pBBad18K的野生型菌株的表型進(jìn)行分析比較。結(jié)果顯示,除了在平板檢測實(shí)驗(yàn)中,所有十個(gè)目的小RNA的過量表達(dá)株對(duì) Zn2+和Ni2+的耐受力均比帶有空的過量表達(dá)載體的野生型菌株(WT/pBBad18K)的明顯下降外,其余所有完成檢測的過量表達(dá)株和缺失突變體的全部檢測表型和對(duì)照菌株一致。這些結(jié)果表明,這十個(gè)小RNA在Xcc對(duì)Zn2+和Ni2+的耐受過程中起重要作用。
　　綜上所述,本工作驗(yàn)證