十字花科黑腐病菌一對推測的雙組份調(diào)控系統(tǒng)基因的功能鑒定.pdf

1、十字花科黑腐病菌，學(xué)名為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（Xanthomonas campestris pv．campestris， Xcc），是一類γ-變形菌，能在世界范圍侵染十字花科植物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失。該菌是研究微生物與寄主相互作用分子機理的重要模式細(xì)菌之一。
　　 本研究在Xcc8004注釋的106個雙組分基因中，綜合生物信息學(xué)分析和突變體庫表型篩選，選擇了8個候選基因進行研究。這8個候選基因的Tn5gusA5插入突

2、變體在寄主植物滿身紅蘿卜上的致病性降低。為了進一步鑒定這幾個基因的功能，我們通過基于pK18mobsacB同源雙交換的方式，分別構(gòu)建這8個基因的缺失突變體。通過對缺失突變體的致病性檢測發(fā)現(xiàn)，XC1149、XC1150這二個ORF的缺失突變體DM1149和DM1150在寄主滿身紅蘿卜上的致病力與其Tn5gusA5插入突變基本一致，均明顯低于野生型Xcc8004。
　　 XC1149和XC1150在基因組上相鄰排列，轉(zhuǎn)錄方向相同并且

3、有4 bp的重疊區(qū)。對XC1149和XC1150的同源性分析表明，很多環(huán)境被生物中都存在XC1149和XC1150的同源基因，在黃單胞菌屬中，Xcc、Xca（Xanthomonas campestris pv． campestris B100）、 Xcv（Xanthomonas campestris pv． vesicatoria）、Xac（Xanthomonas axonopodis pv． Citri．Xac）等中都有分布。編碼產(chǎn)物

4、的結(jié)構(gòu)域分析顯示XC1149的編碼產(chǎn)物是一種雙組份系統(tǒng)感受蛋白，XC1149衍生的蛋白序列具有一個PAS結(jié)構(gòu)域和一個HWE_HK結(jié)構(gòu)域，PAS是一個信號感受結(jié)構(gòu)域，而HWE HK是一個雙組份系統(tǒng)激酶結(jié)構(gòu)域。而XC1150是一個編碼雙組份系統(tǒng)調(diào)節(jié)蛋白的基因，XC1150衍生的蛋白序列具有明顯的REC結(jié)構(gòu)域特征，REC是反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白N端保守的結(jié)構(gòu)域。對XC1149推測的啟動子區(qū)進行分析，發(fā)現(xiàn)在XC1149的起始密碼子上游-266至-241有

5、一個不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腜IP box，序列為TTCGC-N15-TTCCG。
　　 通過對缺失突變體的致病性檢測發(fā)現(xiàn)，DM1149和DM1150在寄主滿身紅蘿卜上的致病力下降，能夠在非寄主植物辣椒上引起過敏性反應(yīng)，但較野生型菌株Xcc8004稍有減弱。生理生化檢測發(fā)現(xiàn)，在重金屬離子、有機溶劑、滲透壓、蛋白質(zhì)變性劑、酸堿脅迫下，突變體DM1149、DM1150耐受脅迫能力明顯低于野生型菌株Xcc8004。與野生型菌株Xcc8004相比，突變

6、體DM1149、DM1150在MMX培養(yǎng)基、NYGB培養(yǎng)基中生長速率沒有顯著差異，胞外多糖及胞外酶的產(chǎn)量也沒有受到影響。游動性和生物膜實驗結(jié)果顯示，XC1149、XC1150并不影響Xcc的游動性和生物膜形成。分別用帶有完整XC1149、XC1150基因的pLALR3互補DM1149、DM1150，互補菌株CDM1149、CDM1150在抗逆性方面可以恢復(fù)到野生型水平，致病力可以恢復(fù)到野生型Xcc8004的90％左右。
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