十字花科黑腐病菌hrpX-hrpG基因間隔區(qū)的轉(zhuǎn)錄和功能分析.pdf

1、十字花科黑腐病菌（Xcc）是引起多種重要的十字花科作物（如白菜、甘藍(lán)、花椰菜、蘿卜、芥菜、油菜等）黑腐病的病原菌。Xcc能感染模式植物擬南芥，是研究植物病原細(xì)菌與寄主植物相互作用機(jī)理的模式菌之一。此外，Xcc還是重要的工業(yè)原料，黃原膠的產(chǎn)生菌。由于Xcc在農(nóng)業(yè)和工業(yè)上的重要性，它的分子生物學(xué)研究越來越受到人們重視。目前，已經(jīng)有3個Xcc菌株(ATCC33913、8004和B100)的全基因組序列被測定。
　　 Xcc8004全基

2、因組編碼蛋白基因序列占84.79％，基因間隔區(qū)序列(Intergenic Regions，IGR)占15.21％。目前，研究IGR的功能已經(jīng)成為功能基因?qū)W研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。最近的研究也發(fā)現(xiàn)，沒有基因注釋的區(qū)域—基因間隔區(qū)也有轉(zhuǎn)錄活性并且具有重要的功能。本研究關(guān)注的問題是:Xcc8004基因組中兩個最重要的致病調(diào)控基因hrpX和hrpG間隔區(qū)是否有轉(zhuǎn)錄活性和生物學(xué)功能。
　　 在Xcc8004基因組中，hrpX(基因ID號:XC

3、_3076)與hrpG(基因ID號:XC_3077)緊密相鄰，但轉(zhuǎn)錄方向相反（hrpX是負(fù)鏈編碼，hrpG是正鏈編碼）;兩個基因的起始密碼子間相隔823 bp。5'-Race結(jié)果顯示，hrpX和hrpG的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于各自的起始密碼子前79 bp和129 bp處。啟動子分析結(jié)果顯示，hrpX轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前68 bp是hrpX的核心啟動子區(qū)，hrpG轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前70 bp是hrpG的核心啟動子區(qū)。因此，hrpX和hrpG間功能未知

4、的區(qū)域有476 bp，我們把它定義為hrpX和hrpG真正的間隔區(qū)，命名為IGRhrpXG。
　　 課題組之前的RNA測序(RNA-seq)結(jié)果顯示，無論是在基本培養(yǎng)基還是在豐富培養(yǎng)基的對數(shù)生長期，均能夠檢測到來自IGRhrpXG的轉(zhuǎn)錄子，預(yù)示IGRhrpXG是有轉(zhuǎn)錄活性的。為了進(jìn)一步確證IGRhrpXG的轉(zhuǎn)錄活性，用RT-PCR方法檢測。RT-PCR結(jié)果顯示，用多對不同的引物均能擴(kuò)增出來自IGRhrpXG的特異RT-PCR產(chǎn)物

5、，證明IGRhrpXG確實(shí)是轉(zhuǎn)錄的。我們試圖采用鏈特異RT-PCR方法確定來自IGRhrpXG的轉(zhuǎn)錄子數(shù)量、大小和轉(zhuǎn)錄方向，但沒有成功。
　　 為了鑒定IGRhrpXG的生物學(xué)功能，保留hrpX和hrpG的核心啟動子區(qū)缺失掉Xcc8004的IGRhrpXG全長476 bp片段，構(gòu)建的缺失突變體8004△IGR476hrpX-G致病力顯著下降和不能誘導(dǎo)“非寄主植物上”發(fā)生過敏性(HR)反應(yīng)。半定量RT-PCR顯示8004△IGR4

6、76hrpX-G hrpX和hrpG基因轉(zhuǎn)錄水平嚴(yán)重降低，說明8004△IGR476hrpX-G的致病力顯著下降和HR反應(yīng)喪失是由于hrpX和hrpG基因轉(zhuǎn)錄水平嚴(yán)重降低造成的。
　　 構(gòu)建了缺失突變體8004△IGR476hrpX-G兩個反式功能互補(bǔ)菌8004△IGR476hrpX-G/pL6-476和8004△IGR476hrpX-G/pL6-828，不能補(bǔ)回致病力和HR反應(yīng)。猜測hrpX和hrpG的核心啟動子不足夠它們正常

7、轉(zhuǎn)錄。
　　 構(gòu)建△hrpG的hrpG基因片段（包含hrpG核心啟動子區(qū)）反式功能互補(bǔ)菌△hrpG/pL6-70hrpG及互補(bǔ)菌8004△IGR476hrpX-G/pL6-70hrpG，表型分析顯示都能補(bǔ)回致病力和HR反應(yīng)。半定量RT-PCR結(jié)果顯示8004△IGR476hrpX-G/pL6-70hrpG的hrpX和hrpG基因轉(zhuǎn)錄水平恢復(fù)正常。證明476bp片段的缺失，保留hrpX和hrpG的核心啟動子區(qū)足夠它們正常轉(zhuǎn)錄。

8、r>　　 為了檢驗(yàn)476 bp片段的作用。將476 bp片段置換回到8004△IGR476hrpX-G的hrpX-hrpG基因間隔區(qū)，構(gòu)建了互補(bǔ)菌8004△IGR476hrpX-G/476，476bp兩邊多出兩個XbaⅠ酶切位點(diǎn)。表型分析結(jié)果顯示都能補(bǔ)回致病力和HR反應(yīng)。8004△IGR476hrpX-G/476的hrpG的轉(zhuǎn)錄水平有一定程度的提高，HrpG濃度增加，足夠激活hrpX轉(zhuǎn)錄，hrpX轉(zhuǎn)錄恢復(fù)到正常水平。
　　 推