一個(gè)用于鑒定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效應(yīng)物轉(zhuǎn)運(yùn)與分泌的報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，簡(jiǎn)稱Xcc)是一種重要的植物病原細(xì)菌，它能在全球范圍內(nèi)侵染所有十字花科植物，從而引發(fā)嚴(yán)重的世界性病害。植物病原細(xì)菌都能產(chǎn)生一種稱之為Ⅲ型效應(yīng)物的致病因子，這種致病因子通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)注入寄主細(xì)胞內(nèi)，從而影響寄主的正常代謝和防御反應(yīng)，幫助病原菌的生長(zhǎng)。因此，對(duì)十字花科黑腐病菌的Ⅲ型效應(yīng)物進(jìn)行全基因組篩選鑒定，為揭示十字花科黑腐病菌的致病機(jī)理打下基礎(chǔ)

2、。
　　 目前，十字花科黑腐病菌Ⅲ型效應(yīng)物的轉(zhuǎn)運(yùn)與分泌檢測(cè)可以分別通過(guò)體內(nèi)與體外兩種檢測(cè)方法，體外檢測(cè)是將將候選基因啟動(dòng)子區(qū)和信號(hào)區(qū)克隆至表達(dá)載體，該表達(dá)載體上攜帶一個(gè)很小的免疫識(shí)別標(biāo)簽（比如3×FLAG標(biāo)簽），在離體培養(yǎng)條件下，利用免疫學(xué)手段(Western Blotting)檢測(cè)在培養(yǎng)物中該融合蛋白的存在與否，這種方法靈敏度較高，能夠應(yīng)用于檢測(cè)分泌量低的效應(yīng)物的分泌。體內(nèi)檢測(cè)是在植物組織上利用病原菌可以在非寄主或抗性寄主上誘

3、發(fā)過(guò)敏反應(yīng)(HR反應(yīng))的特性或免疫化學(xué)標(biāo)記方法鑒定效應(yīng)物蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。利用HR反應(yīng)特性建立的檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度不高，不適用于分泌量低的Ⅲ效應(yīng)物的鑒定。而免疫化學(xué)標(biāo)記的檢測(cè)手段檢測(cè)靈敏度較高，目前該檢測(cè)手段是利用百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis依賴于鈣調(diào)素的腺苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域(CyaA)作為報(bào)告信號(hào)，通過(guò)免疫反應(yīng)定量檢測(cè)cAMP含量，以確定Ⅲ型效應(yīng)物的轉(zhuǎn)運(yùn)。為了通過(guò)體內(nèi)體外兩種檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)十字花科黑腐病菌Ⅲ型效應(yīng)物

4、的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，本文將cyaA基因克隆至帶有3×FLAG的pJXG載體上，構(gòu)建出帶有3×FLAG和cyaA基因的報(bào)告質(zhì)粒pJAA，并利用已鑒定為Ⅲ型效應(yīng)物的XC_1553啟動(dòng)子區(qū)和信號(hào)區(qū)檢驗(yàn)該報(bào)告質(zhì)粒是否能正常工作。將重組質(zhì)粒pJAA1553通過(guò)三親結(jié)合導(dǎo)入8004*和8004*△hrcV菌株，然后通過(guò)Western Blotting檢測(cè)XC_1553的分泌情況，結(jié)果在8004*/pJAA1553的胞外蛋白中檢測(cè)到了XC_1553的分泌信

5、號(hào)，而在負(fù)對(duì)照8004*△hrcV/pJAA1553的胞外蛋白中沒有檢測(cè)到XC_1553的分泌。同時(shí)通過(guò)化學(xué)免疫反應(yīng)定量檢測(cè)8004*/pJAA1553和8004*△hrcV/pJAA1553侵染后植物體內(nèi)的cAMP含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8004*/pJAA1553侵染后植物體內(nèi)的 cAMP含量比8004*AhrcV/pJAA1553侵染后植物體內(nèi)的cAMP含量高15倍。結(jié)果表明，報(bào)告質(zhì)粒pJAA能夠正常工作，可以應(yīng)用于檢測(cè)十字花科黑腐病菌的Ⅲ