乙型肝炎病毒X基因在乙型病毒相關(guān)性腎炎中的致病作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　 為了進一步明確HBx基因在乙肝病毒相關(guān)性腎小球腎炎中的致病作用及相關(guān)機制，我們通過對22例HBV-GN患者的腎活檢組織中腎小管上皮細胞的凋亡、凋亡相關(guān)蛋白及HBx表達進行相關(guān)分析;通過構(gòu)建真核表達載體將HBx基因轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中，探討HBx基因?qū)δI小管上皮細胞的增殖和凋亡的影響，為乙肝病毒相關(guān)性腎炎分子機制的研究提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、應(yīng)用免疫組織化學的方法對22例H

2、BV-GN患者及5例對照組腎組織分別檢測HBx、p-STAT3、STAT3、Bcl-2及Bax蛋白的表達
　　 2、采用TUNEL標記法檢測22例HBV-GN患者及5例對照組腎組織中腎小管上皮細胞的凋亡
　　 3、分析22例HBV-GN患者腎組織中腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)與HBx表達、患者臨床蛋白尿及HBVDNA定量的相關(guān)性
　　 4、HBx基因真核表達載體pcDNA3.1-HBx的構(gòu)建和鑒定
　　 從He

3、pG2.2.15細胞中提取總RNA，以總RNA為模板，采用RT-PCR方法擴增目的基因HBx(464bp)，將后者克隆到載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HBx。后者通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、提取、電泳、測序以及酶切等方法進行鑒定。
　　 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1-HBx轉(zhuǎn)染至HK-2細胞，并用WB法檢測目的蛋白HBx的表達。
　　 5、CCK-8法檢測細胞增殖抑制率
　　 收集

4、處于對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板，每孔100ul。細胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及pc-DNA3.1-HBx，并設(shè)對照組。細胞在37℃，飽和濕度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h。CCK-8法檢測各孔吸光度值（OD值），計算細胞生存率及增殖抑制率。
　　 6、流式細胞儀檢測細胞凋亡
　　 收集處于對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板。細胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及pc-DNA3.1-HBx，并設(shè)對照組及AG490干預(yù)

5、組。細胞在37℃，飽和濕度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h。消化收集各組細胞，Annexin V-FITC/PI染色，流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡百分比。
　　 7、共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)
　　 收集處于對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板。細胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及pc-DNA3.1-HBx，并設(shè)對照組。在37℃，飽和濕度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h。固定細胞后，Hoechst3

6、3342熒光染料染色，共聚焦熒光顯微鏡觀察、攝片。
　　 8、透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)
　　 收集處于對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板。細胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及pc-DNA3.1-HBx，并設(shè)對照組。細胞在37℃，飽和濕度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h。消化收集各組細胞，置于2.5％戊二醛中固定。制成超薄切片，于透射電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。
　　 9、細胞免疫熒光/免疫化學檢測細胞JAK2、S

7、TAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達
　　 收集處于對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板或12孔板中爬片。細胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及pc-DNA3.1-HBx，并設(shè)對照組及AG490干預(yù)組。細胞在37℃，飽和濕度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h。細胞固定后，細胞免疫熒光/免疫化學法檢測JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達，顯微鏡下觀察、攝片。
　　 10、Western

8、 blot方法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達
　　 收集各組細胞，提取蛋白，用Western blot方法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1、兩組患者腎組織HBx、p-STAT3、STAT3、Bax及Bcl-2的表達
　　 86％(19/22)的HBV-GN患者腎組織內(nèi)存在不同程度的H

9、Bx表達，其主要分布于腎小管上皮細胞胞漿，腎小球內(nèi)也有少數(shù)分布。與對照組比較，HBV-GN中STAT3、p-STAT3表達明顯增強，Bax表達亦明顯增加，而Bcl-2表達明顯下降(均P＜0.05)。
　　 2、兩組患者腎組織腎小管上皮細胞的凋亡
　　 HBV-GN患者腎組織可見TUNEL陽性細胞，凋亡指數(shù)為（16.82±3.35％），少數(shù)腎小球內(nèi)也可見凋亡細胞。對照組腎組織極少見凋亡細胞。
　　 3、HBV-GN

10、患者腎組織腎小管上皮細胞的凋亡指數(shù)與HBx表達、臨床蛋白尿及HBV-DNA的相關(guān)性
　　 HBV-GN組患者腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)與腎臟HBx表達有顯著相關(guān)性(r=0.612，P=0.032)。凋亡指數(shù)與24h蛋白尿有顯著相關(guān)性(r=0.824，P=0.020)。凋亡指數(shù)與HBV-DNA復(fù)制量無顯著相關(guān)性(P=0.738)。
　　 4、HBx基因真核表達載體pcDNA3.1-HBx的構(gòu)建和鑒定
　　 測序分析顯示

11、:HBx編碼基因與Genbank發(fā)表的序列相符(ID:944566)。pcDNA3.1-HBx經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切釋出插入子，與HBx基因(464bp)大小相一致。
　　 pcDNA3.1-HBx轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞24h后，Western blot分析顯示，有分子量為17kD的HBx蛋白表達，72h達高峰。
　　 5、CCK-8法檢測細胞增殖抑制率
　　 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細胞存活率與對照組無明顯差別，提示對

12、細胞無明顯增殖抑制作用(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24h后，對細胞的增殖有明顯抑制作用，達到（14.08±2.14）％。轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx48h后，細胞的增殖抑制率顯著增加，達到(31.33±2.24)％。轉(zhuǎn)染72h后，細胞的增殖抑制率達到(35.27±1.10)％，與24h有顯著增加(P＜0.05)，但與48h無明顯差別(P＞0.05)。
　　 6、流式細胞儀檢測細胞凋亡
　　 轉(zhuǎn)染空質(zhì)

13、粒組細胞凋亡率與對照組無明顯差異(P＞0.05);轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24小時組細胞的凋亡率為（15.12±1.98）％;轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx48小時組細胞的凋亡率（20.62±2.23）％;pc-DNA3.1-HBx72小時組細胞的凋亡率為（23.80±2.16）％。轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx后各組細胞的凋亡率較對照組組均顯著增高，差異具有顯著性(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染48小時較轉(zhuǎn)染24小時組凋亡率顯著增高，差異

14、有顯著性(P＜0.05)。但轉(zhuǎn)染后48小時與轉(zhuǎn)染后72小時無統(tǒng)計學差異。AG490干預(yù)組凋亡率為（14.34±2.63）％，與未干預(yù)組有顯著差別(P＜0.05)。
　　 7、共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)
　　 對照組及轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組細胞核形態(tài)正常;轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒24h、48h、72h組均可見細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，細胞核染色質(zhì)呈高度凝聚，核碎裂等。
　　 8、透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)
　　

15、 對照組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細胞核近于圓形，核仁偏位存在，核膜清晰。HBx24h組、48h組、72h組:核仁不規(guī)則，有凹陷，核膜水腫，核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚、邊集。
　　 9、細胞免疫熒光/免疫化學檢測JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達
　　 在對照組中，JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白均主要表達于胞漿，且p-STAT3蛋白表達很弱;轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24小時組后p-STAT3蛋白水平

16、明顯增加，在72h時表達水平最高;轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24小時后，總JAK2及STAT3蛋白水平亦明顯增加，在72小時達高峰，主要在胞漿表達。在對照組中，Bcl-2有較高水平表達。轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24小時組后Bcl-2表達水平有所下降，在72h表達水平降至最低。Bax在對照中腎小管上皮細胞中有少量表達;轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24小時組后Bax表達水平有所上升，在72h在胞漿呈現(xiàn)高水平表達。AG490干預(yù)后

17、，p-STAT3、STAT3及JAK2表達水平均有所下降。
　　 10、Western blot方法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達
　　 對照組細胞中JAK2及STAT3有少量磷酸化，轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24h后，p-JAK2及p-STAT3的表達均明顯增高;總JAK2及STAT3表達也明顯增高，隨著轉(zhuǎn)染時間延長，蛋白表達呈現(xiàn)逐漸增強趨勢，轉(zhuǎn)染72h達到高峰（P

18、均＜0.05）。Bcl-2在對照組呈高水平表達，轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24h后，Bcl-2表達水平開始下降，至轉(zhuǎn)染后72h降至最低（均P＜0.05）。Bax在對照組呈較低水平表達，轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24h后，Bax表達水平開始增加，至轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx72h后，Bax表達水平最高（均P＜0.05）。AG490干預(yù)后，p-JAK2及p-STAT3的表達明顯下降;Bcl-2水平增加，Bax蛋白水平降低（均P＜