綠色熒光蛋白基因在胡蘿卜細(xì)胞中的高效表達(dá)及其轉(zhuǎn)化體的篩選研究.pdf

1、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物具有生長(zhǎng)迅速、周期短、易于工業(yè)化控制、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中。但是由于植物細(xì)胞培養(yǎng)自身特點(diǎn)所致，迄今為止實(shí)現(xiàn)工業(yè)化培養(yǎng)的植物細(xì)胞種類不多，其中光照是一個(gè)非常重要的影響因素，光照時(shí)間的長(zhǎng)短、光質(zhì)和光的強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累都有一定的影響。目前植物細(xì)胞培養(yǎng)的光照，往往考慮在普通生物反應(yīng)器上增加光照系統(tǒng)，但許多資料研究表明，在生物反應(yīng)器上安裝光源并不能很好的解決植物細(xì)

2、胞所需的光照問題。為了找到解決植物細(xì)胞培養(yǎng)光照問題的方法，本課題探索著從內(nèi)生光的角度出發(fā)，即通過植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲取具有發(fā)光能力的細(xì)胞，利用發(fā)光細(xì)胞所產(chǎn)生的光作為光源提供給植物細(xì)胞培養(yǎng)。 發(fā)光生物在自然界中廣泛存在，如螢火蟲、發(fā)光細(xì)菌、水母等，這些發(fā)光生物體內(nèi)的熒光素均己被確知，且有部分熒光素基因如水母體內(nèi)的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因已被克隆并導(dǎo)入到其它生物體內(nèi)，重組生物體具

3、有與水母類似的發(fā)光性質(zhì)。本課題試圖通過植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲取發(fā)光植物細(xì)胞：通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的方法，將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒PBIl21-EGFP中的EGFP基因?qū)牒}卜細(xì)胞中，并抗性篩選出具有高效穩(wěn)定表達(dá)的發(fā)出熒光的細(xì)胞，為進(jìn)一步探索通過發(fā)光植物細(xì)胞為細(xì)胞培養(yǎng)提供或補(bǔ)充光照提供基礎(chǔ)性研究。主要研究結(jié)果如下： 1．EHA105介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化胡蘿卜細(xì)胞 利用凍融法成功地將重組質(zhì)粒PBIl21-EGFP導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA10

4、5，并確定了最佳轉(zhuǎn)化效果時(shí)重組質(zhì)粒的濃度。 重組農(nóng)桿菌：EHA105介導(dǎo)：EGFP基因轉(zhuǎn)化胡蘿卜細(xì)胞，轉(zhuǎn)化體系為：胡蘿卜愈傷組織預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為10d，農(nóng)桿菌EHA105的浸染濃度為OD<,600>:0.4，浸染時(shí)間25min，共培養(yǎng)條件：25℃、黑暗、培養(yǎng)時(shí)間3d，脫菌時(shí)抗生素頭孢噻肟鈉濃度為250mg/L，篩選時(shí)卡那霉素濃度為50mg/L。結(jié)論：熒光顯微鏡下觀測(cè)到綠色熒光細(xì)胞團(tuán)，并用PCR法檢測(cè)出目的基因條帶，證實(shí)目的基因

5、EGFP已成功導(dǎo)入胡蘿卜細(xì)胞并獲得表達(dá)，轉(zhuǎn)化效率約為10％，轉(zhuǎn)化細(xì)胞團(tuán)發(fā)出的熒光強(qiáng)度較弱。 2．EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法改進(jìn) 乙酰丁香酮(AS)不同使用方式下的轉(zhuǎn)化效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在固態(tài)共培養(yǎng)基中加入AS時(shí)其轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)90％(以細(xì)胞團(tuán)數(shù)計(jì)算)，且轉(zhuǎn)化體的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)；在植物細(xì)胞表面上加AS時(shí)轉(zhuǎn)化效率約為80％(以細(xì)胞團(tuán)數(shù)計(jì)算)，轉(zhuǎn)化體發(fā)光強(qiáng)度比固態(tài)培養(yǎng)基中加入AS時(shí)略弱；在液態(tài)培養(yǎng)基中加入AS已在第二章實(shí)驗(yàn)

6、過，其轉(zhuǎn)化效率約為10％(以細(xì)胞團(tuán)數(shù)計(jì)算)，且熒光強(qiáng)度較弱。 結(jié)論：在固態(tài)培養(yǎng)基中加入As的方法可明顯提高轉(zhuǎn)化效率。 采用液態(tài)共培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：通過配制適宜農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞共同生長(zhǎng)的液態(tài)培養(yǎng)基，并利用該液態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示：所得到的轉(zhuǎn)化體的熒光強(qiáng)度比在固態(tài)共培養(yǎng)基中加入AS還要強(qiáng)，其轉(zhuǎn)化效率約為10％。 3．溫度與抗生素結(jié)合脫菌實(shí)驗(yàn) 將共培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化體置于37℃條件下培養(yǎng)3d，取出移至含有

7、頭孢噻肟鈉(250mg/L)的新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果：脫菌效果明顯，EHA105在l8d內(nèi)能得到有效的抑制，比單獨(dú)采用抗生素脫菌的抑制效果(抑制時(shí)間一般為6-7d)明顯增強(qiáng)。 4．單細(xì)胞轉(zhuǎn)化及其篩選實(shí)驗(yàn) 在含有胡蘿卜單細(xì)胞的MS液態(tài)培養(yǎng)基中加入EHA105菌液，然后將此MS培養(yǎng)液與等體積的MS固態(tài)培養(yǎng)基混合，再鋪在培養(yǎng)皿上，厚度約2mm，培養(yǎng)皿置于25℃、黑暗條件下培養(yǎng)3d。結(jié)果顯示：大量小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞發(fā)出綠光，在