卵巢早衰患者血漿游離DNA特性及甲基化研究.pdf

1、卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是原發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）發(fā)展的終末階段，此時(shí)原始卵泡池處于耗竭狀態(tài)，并且此種耗竭狀態(tài)是不可逆的，臨床上表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕以及骨質(zhì)疏松、潮熱多汗等絕經(jīng)期癥狀。POF在臨床上并不少見，有調(diào)查表明30歲以內(nèi)女性 POF的發(fā)病率約為千分之一，40歲以內(nèi)的發(fā)病率約為百分之一。
　　POF的相關(guān)病因多且復(fù)雜，目

2、前的研究表明，遺傳因素、免疫因素、代謝因素、醫(yī)源性損傷、病毒感染和其他環(huán)境因素等都可能導(dǎo)致卵巢早衰的發(fā)生。但是，截至目前為止，卵巢早衰的確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前發(fā)現(xiàn)多個(gè)可能與POF發(fā)病有關(guān)的基因都與凋亡過程相關(guān)。例如MLH3基因突變導(dǎo)致減數(shù)分裂不能正常進(jìn)行，使異常卵母細(xì)胞出現(xiàn)了快速凋亡；PGRMC1基因錯(cuò)義突變會(huì)損傷卵巢發(fā)育中孕酮的抗凋亡作用，使得卵泡的過早丟失，最終導(dǎo)致POF。根據(jù)電泳的方法發(fā)現(xiàn)細(xì)胞游離 DNA（cell-fr

3、ee DNA，cfDNA）與凋亡細(xì)胞形成的條帶相一致，并且T淋巴細(xì)胞等活性細(xì)胞DNA的主動(dòng)釋放也會(huì)形成相似的條帶。由此表明，cfDNA可能主要來源于細(xì)胞凋亡和活性細(xì)胞新合成DNA的主動(dòng)釋放。因此，我們以cfDNA為切入點(diǎn)探究細(xì)胞凋亡是否影響POF的發(fā)病。
　　除此之外，DNA甲基化是生物體內(nèi)一種不可或缺的多種酶參與的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式。高等的真核生物可以通過DNA甲基化狀態(tài)的改變來調(diào)控基因是否表達(dá)以及表達(dá)的程度。研究表明，多種疾病

4、中普遍存在DNA的異常甲基化的現(xiàn)象，尤其是在腫瘤中，這可能是腫瘤的發(fā)病中最早出現(xiàn)的改變。cfDNA作為不同于細(xì)胞內(nèi)DNA的遺傳物質(zhì)，有其特有的來源與生物學(xué)特性。其中 cfDNA甲基化特性可能成為較多相關(guān)疾病的診斷靶標(biāo)。現(xiàn)有的多項(xiàng)研究表明，在多種疾病中cfDNA相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，并且已經(jīng)開始探討將其作為特異性診斷指標(biāo)應(yīng)用于臨床實(shí)踐的可能性。故從cfDNA特異基因甲基化角度來探究POF發(fā)病機(jī)制，對(duì)卵巢早衰的早診斷、早治療以及預(yù)后

5、判斷有重大的意義。
　　目的
　　通過探究POF患者血漿中cfDNA的含量及完整性的特征以及cfDNA的甲基化的特點(diǎn)，為POF發(fā)病機(jī)制的研究提供新的角度。
　　方法
　　本研究的研究對(duì)象為本中心被診斷為卵巢早衰（POF）的患者，研究樣品為患者的血漿細(xì)胞游離DNA，以卵巢功能正常的女性為對(duì)照。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time-qPCR, RT-qPCR）絕對(duì)定量法檢測(cè)細(xì)胞游離DNA的含量，通過計(jì)算不同片段

6、長(zhǎng)度細(xì)胞游離DNA的比例得到細(xì)胞游離DNA的完整性指數(shù)。采用甲基化芯片技術(shù)檢測(cè)血漿cfDNA的甲基化狀態(tài)，再用GO分析法探索差異甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因的聚類信息。
　　結(jié)果
　　通過Real time-qPCR的方法，用引物ALU115進(jìn)行Real-time PCR得到的CT值所計(jì)算的到的cfDNA濃度，代表血漿中全部的cfDNA含量，引物ALU247進(jìn)行Real time-qPCR得到的CT值所計(jì)算的到的cfDNA濃度，則代表

7、血漿中較大片段的cfDNA含量。通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，POF組的血漿cfDNA濃度高于對(duì)照組（9.76ng/μl vs.3.73ng/μl，p<0.001），POF組的血漿cfDNA完整性低于對(duì)照組（8.35％vs.22.41%，p<0.001）。
　　POF組和對(duì)照組患者的血清 cfDNA經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后，用 BeadChip Array Inf Methyl8 Sample Beadchip甲基化芯片對(duì)其進(jìn)行甲基化分析，發(fā)現(xiàn)有

8、127724個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平存在顯著差異。POF組和對(duì)照組中差異甲基化位點(diǎn)分布在CpG高密度區(qū)和CpG中密度區(qū)比例分別為39.52%和43.68%。對(duì)基因組功能區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子區(qū)（TSS1500、TSS200及1st Exon）的差異甲基化位點(diǎn)占36.66%。用DAVID網(wǎng)站對(duì)POF組和對(duì)照組中差異甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行GO分析，包括細(xì)胞組分、分子功能和生物過程。差異甲基化位點(diǎn)所在基因主要定位于細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、胞質(zhì)外體等細(xì)

9、胞組分；具有蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合和RNA結(jié)合和GTPase激活劑活性等分子功能；參與正向調(diào)節(jié)GTPase活性、蛋白磷酸化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及正向調(diào)節(jié)凋亡等生物過程。利用 KEGG分析差異甲基化位點(diǎn)所在基因參與的信號(hào)通路。結(jié)果顯示，POF組和對(duì)照組相比，差異甲基化位點(diǎn)所在基因主要參與MAPK信號(hào)通路、內(nèi)吞作用以及雌激素信號(hào)通路、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟及GnRH信號(hào)通路等。
　　結(jié)論
　　1.卵巢早衰患者血漿中cfDNA的含量增