DNA甲基化異常與多囊卵巢綜合征的關系及機制研究.pdf

1、第一部分:多囊卵巢綜合征候選基因甲基化水平的研究
　　背景:
　　早在1935年，美國婦科醫(yī)生Stein與Leventhal便描述了閉經或月經稀發(fā)，不孕，多毛，肥胖和卵巢多囊性增大這一系列癥狀，并稱為Stein-Leventhal綜合征，也就是我們現(xiàn)在慣稱的多囊卵巢綜合征。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的不斷發(fā)展，我們對于這一古老疾病的認識不斷更新，不斷深入，現(xiàn)在我們已經認識到多囊卵巢綜合征不僅僅是單純的涉及育齡婦女的生殖內分泌疾病，多囊卵巢

2、綜合征還可對女性糖脂代謝、心血管、皮膚、骨骼、以及心理產生重大而深遠的影響。多囊卵巢綜合征是多病因發(fā)病，從青春期遷延至絕經期的，呈現(xiàn)高度異質性的，涉及多個系統(tǒng)的復雜性疾病，是令人談之色變的貫穿女性一生的夢魘。
　　最新的流行病學調查顯示，在我國婦女中，多囊卵巢綜合征的患病率高達5.6％(4)。攻克多囊卵巢綜合征難題具有深遠的意義，然而，要想徹底攻克多囊卵巢綜合征診斷治療方面的諸多難題，從根本上解密多囊卵巢綜合征的發(fā)病機制刻不容緩。

3、現(xiàn)今，多囊卵巢綜合征的病因主要分為遺傳和非遺傳兩個方面。在遺傳方面，我們研究組通過前期全基因組關聯(lián)分析的方法確定了多個多囊卵巢綜合征易感基因，然而在非遺傳方面，研究尚少有涉及，特別是多囊卵巢綜合征的表觀遺傳學研究正越來越多的引起人們的重視。在哺乳動物中，表觀遺傳學信息可以表現(xiàn)為多種形式，DNA的甲基化是最早被人們所認識也是研究最多的方向。正常細胞功能的行使有賴于表觀遺傳的穩(wěn)態(tài)的維持，而已有大量研究表明表觀遺傳的穩(wěn)態(tài)的打亂是與多種疾病的發(fā)

4、病相關的，其中就包括多種復雜疾病以及癌癥。甲基化是表觀遺傳學中為人們認識最早也是了解的最清楚地現(xiàn)象。本部分研究便是從這些候選基因出發(fā)，研究這些多囊卵巢綜合征易感基因的甲基化水平在病患之中是否有變化。
　　目的:
　　我們通過篩選前期全基因組關聯(lián)分析的結果，選取了THADA(thyroid adenoma associated),LHCGR(Luteinizing hormone/choriogonadotropin rece

5、ptor)以及TOX3(Thymocyte selection-associated high mobility group box)3個多囊卵巢綜合征候選基因。通過采集多囊卵巢綜合征患者以及正常受試者的外周血DNA，以重亞硫酸測序的方法檢測上述基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，以圖找到多囊卵巢綜合征中甲基化異常的候選基因。
　　方法:
　　我們收集了30例多囊卵巢綜合征患者以及30例年齡匹配的正常受試者的外周血標本，提取基因組D

6、NA后，重亞硫酸測序的方法檢測上述基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，并進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　在多囊卵巢綜合征標本的LHCGR基因啟動子區(qū)域的各個CpG位點的甲基化水平普遍呈較低的水平，雖然整體甲基化水平的差異并未達到統(tǒng)計學水平，單個位點的甲基化水平的分析顯示，-141位點和+17位點的低甲基化的顯著程度達到了統(tǒng)計學水平(CpG-141:10.89％Vs.18.31％,P=0.023;CpG+17:2.02％Vs.8.4

7、5％,P=0.002)，經過FDR法的校正后+17位點的低甲基化程度仍達到了統(tǒng)計學水平。其他兩個基因，TOX3和THADA，它們的啟動子區(qū)域呈普遍的去甲基化狀態(tài)，多囊卵巢綜合征病人與非多囊卵巢綜合征病人之間并無區(qū)別。
　　結論:
　　通過篩選多囊卵巢綜合征候選基因的甲基化水平，我們發(fā)現(xiàn)了多囊卵巢綜合征患者中LHCGR這一在生殖調節(jié)上有重要作用的基因的甲基化水平的異常，為多囊卵巢綜合征表觀遺傳學發(fā)病機制提供了證據，為進一步確證

8、LHCGR甲基化水平的異常以及探求其中機理奠定了基礎。
　　第二部分:LHCGR基因啟動子區(qū)域甲基化水平與多囊卵巢綜合征的關系
　　背景:
　　在第一部分的研究中，我們篩查了多個多囊卵巢綜合征候選基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，其中，我們發(fā)現(xiàn)了在多囊卵巢綜合征患者外周血DNA中的LHCGR基因啟動子區(qū)域甲基化程度偏低的現(xiàn)象。LHCGR是黃體生成素以及絨毛膜促性腺激素的受體，是一種主要在卵巢以及睪丸表達的跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，

9、LHCGR的活化在人類生殖過程中的激素功能有著至關重要的作用。在人類卵巢中，LHCGR在顆粒細胞、卵泡膜細胞、黃體細胞以及間質細胞中表達，在卵泡發(fā)育和甾體激素的合成等重要生物學事件有著舉足輕重的地位。更巧合的是，在由DHEAs誘導的PCOS小鼠模型的卵巢組織中，人們亦發(fā)現(xiàn)了LHCGR去甲基化的現(xiàn)象。既往文獻顯示，LHCGR的轉錄活性的調節(jié)主要受到其啟動子區(qū)域CpG位點甲基化水平的影響。因為同一位點的甲基化的水平在不同組織和細胞類型中是不

10、同的，為了驗證這個假說，僅僅得到外周血中的數據是不足夠的，因此，我們又以體外受精一胚胎移植(IVF-ET)過程中得到的顆粒細胞為對象，檢測了其中LHCGR基因啟動子區(qū)域甲基化程度。顆粒細胞中異常的LHCGR甲基化水平或許通過影響LHCGR的轉錄在多囊卵巢綜合征的發(fā)病中起作用。另一方面，業(yè)已證明婦女中LHCGR的基因突變可能導致高雄激素血癥的表型，因此LHCGR的編碼序列和非翻譯序列有待于進一步測序以排除可能的突變的存在。
　　目的

11、:
　　由于在第一部分中，我們發(fā)現(xiàn)了多囊卵巢綜合征患者外周血白細胞中LHCGR基因啟動子區(qū)域甲基化程度降低的現(xiàn)象，為了驗證不同的細胞類型中是否有類似的情況，我們采用IVF-ET過程中的不孕患者的顆粒細胞，檢測了顆粒細胞中的LHCGR的甲基化情況，以驗證LHCGR低甲基化是否存在于多種細胞中，并且檢驗異常的LHCGR甲基化水平是否影響LHCGR的轉錄，從而確定LHCGR甲基化在多囊卵巢綜合征的發(fā)病中起作用。另一方面，多囊卵巢綜合征婦

12、女的LHCGR基因的編碼序列、啟動予以及非翻譯區(qū)將被測序，以排除可能的遺傳變異的存在。
　　方法:
　　我們通過密度梯度離心的方法收集IVF-ET過程中不孕患者卵泡液中的顆粒細胞，其中有12份樣本來自多囊卵巢綜合征患者，12份樣本來自年齡匹配的正常受試者，提取DNA后，以重亞硫酸鹽測序的方法，檢測了顆粒細胞中LHCGR基因啟動子區(qū)域的甲基化程度，并使用real time qPCR的方法檢測了LHCGR的轉錄水平，且用west

13、ern blotting的方法檢測了LHCGR的表達水平。另一方面，我們首先以DNA測序的方法檢測192名多囊卵巢綜合征病人的LHCGR的編碼序列、啟動子以及非翻譯區(qū)。
　　結果:
　　在接受輔助生殖技術治療患者的顆粒細胞中的LHCGR基因啟動子區(qū)域甲基化水平的檢測中，重亞硫酸鹽測序的結果顯示多囊卵巢綜合征患者的LHCGR基因啟動子區(qū)域呈總體低甲基化狀態(tài)(P=0.004)，其中CpG-174，-148，-61，-43，-8，

14、+10，+17以及+20在多囊卵巢綜合征患者中的甲基化程度明顯降低(CpG-174:14.00％vs.19.41％,correctedP=0.048;CpG-148:9.60vs.15.19％,correctedP=0.048;CpG-61:5.60％vs.10.13％correctedP=0.048;CpG-43:5.60％vs.10.13％correctedP=0.048;CpG-8:9.60％vs.14.77％,corrected

15、P=0.046;CpG+10:6.00％vs.10.13％correctedP=0.047;CpG+17:4.80％vs.10.13％correctedP=0.050;CpG+20:4.80％vs.10.13％,correctedP=0.050)。RealtimePCR以及westernblotting的結果顯示多囊卵巢綜合征患者顆粒細胞的LHCGR轉錄和翻譯水平升高。另一方面，通過對192例多囊卵巢綜合征病人的DNA測序并未發(fā)現(xiàn)新發(fā)突

16、變，僅發(fā)現(xiàn)3個已知SNP(rs2293275,rs11125179和rs10176989)。
　　結論:
　　LHCGR基因作為多囊卵巢綜合征的重要易感基因，其DNA序列在多囊卵巢綜合征患者中并未發(fā)現(xiàn)變異。而通過多種方法多種細胞類型的檢測，其基因啟動子區(qū)域呈明顯的低甲基化狀態(tài)，并使得LHCGR轉錄升高，可能參與PCOS的發(fā)病過程。
　　第三部分:導致多囊卵巢綜合征LHCGR基因甲基化水平紊亂因素的研究
　　背景:

17、
　　通過前面兩部分的研究，驗證了多囊卵巢綜合征LHCGR基因啟動子區(qū)域甲基化水平紊亂在外周血以及顆粒細胞中的存在，且在顆粒細胞中，此種甲基化紊亂還是與LHCGR的表達變化的趨勢相同。在這個部分中，我們將從多個方面探尋可能影響多囊卵巢綜合征患者中LHCGR甲基化紊亂的可能因素。在常染色體非印記基因中也廣泛存在等位基因特異性的甲基化現(xiàn)象，通常表現(xiàn)為SNP的基因型與鄰近的CpG位點甲基化水平之間的關聯(lián)。在本項研究中，我們研究LHCGR

18、基因的原因是因為位于其內含子的rs13405728這一SNP在我們前期的GWAS研究中達到了基因組顯著水平，在前面的研究中，受制于樣本量和實驗方法的限制，我們不能得出SNP與甲基化水平之間的關系，因此我們在本部分的研究中，繼續(xù)擴大了樣本量，將rs13405728以及rs4073366兩個SNP的基因分型信息與啟動子區(qū)域甲基化水平。另外一個方面，激素水平可能導致甲基化程度的變化。高雄激素血癥是多囊卵巢綜合征最基礎的特征之一，高LH血癥也是

19、多囊卵巢綜合征的一個特點，并被列為日本制訂的多囊卵巢綜合征診斷標準之一，這兩大激素引起了我們的興趣，在這一部分研究中，我們將體外培養(yǎng)21天小鼠的顆粒細胞，在培養(yǎng)液中加入不同濃度的睪酮和LH，以觀察是否對LHCGR基因的甲基化以及表達水平有影響，以探討多囊卵巢綜合征患者激素水平的異常與LHCGR甲基化水平之間的關系。
　　目的:
　　本部分主要探討兩個可能導致甲基化水平異常的因素，首先我們將檢驗全基因組關聯(lián)分析所得的易感位點r

20、s13405728基因型與LHCGR啟動子區(qū)域甲基化水平的關系，再以這部分數據為基礎，對所有標本的LHCGR的5'非翻譯區(qū)的rs4073366進行基因分型，再檢驗rs4073366分型結果與甲基化水平的關系。另一方面，我們還將檢測兩種多囊卵巢綜合征特征性的激素水平異常對于LHCGR甲基化水平的影響。
　　方法:
　　我們首先利用前期全基因組關聯(lián)分析的數據和標本，按照rs13405728的基因型挑選90份多囊卵巢綜合征標本以及

21、90份正常對照標本，使用焦磷酸測序的方法檢測了這些多囊卵巢綜合征和健康對照標本的LHCGR基因啟動子區(qū)域甲基化水平，以分析rs13405728與甲基化水平之間的關系;用直接測序的方法對rs4073366進行基因分型，分析rs4073366是否影響甲基化水平。另一方面，我們還利用小鼠的顆粒細胞體外加藥培養(yǎng)的方法，針對性的研究了睪酮以及LH對于LHCGR基因啟動子區(qū)域甲基化水平。
　　結果:
　　在多囊卵巢綜合征以及對照者標本中

22、，基因型對于LHCGR啟動子區(qū)域甲基化水平影響的趨勢是相同的，AA基因型導致各個位點的甲基化程度較高，GG基因型則導致各個位點的甲基化程度較低，雜合的AG基因型的標本的則處于兩種純和基因型之間，如果將多囊卵巢綜合征標本數據和對照數據混合后，這種區(qū)別依然存在，且這種區(qū)別是達到了統(tǒng)計學水平的(P＜0.05)。rs4073366則沒有明顯的對于LHCGR甲基化水平的影響。生理濃度的10-9M睪酮濃度的培養(yǎng)液組的LHCGR啟動子區(qū)域則呈現(xiàn)較高的

23、甲基化狀態(tài)，高濃度的睪酮可導致去甲基化的發(fā)生。
　　結論:
　　rs13405728可以等位基因特異性的影響LHCGR的甲基化水平，而較高的睪酮水平將會導致LHCGR去甲基化的發(fā)生，我們在多囊卵巢綜合征病人中發(fā)現(xiàn)的LHCGR甲基化水平的變化可能是這兩個因素所導致的。
　　第四部分:多囊卵巢綜合征外周血全基因組DNA甲基化水平研究
　　背景:
　　多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女最為常見的生殖內分泌疾病

24、，其發(fā)病率高達6-8％。然而多囊卵巢綜合征的病理生理過程仍不為我們所知，在過去的十多年中，多囊卵巢綜合征發(fā)病的遺傳因素被廣泛的研究。我們最近的基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了多個多囊卵巢綜合征的易感基因，然而這些易感基因的發(fā)現(xiàn)不足以解釋多囊卵巢綜合征的異質性與復雜性，現(xiàn)在的理論認為，遺傳、表觀遺傳以及環(huán)境因素共同構成多囊卵巢綜合征的發(fā)病因素。
　　正常細胞功能有賴于表觀遺傳組的穩(wěn)態(tài)，現(xiàn)在越來越多的研究表明表觀遺傳組的紊亂與多種人類疾病相關，特

25、別是癌癥與復雜疾病。對于多囊卵巢綜合征來說，人們越來越意識到這一領域的重要性，個別研究表明了多囊卵巢綜合征的某些基因(LMNA，follistatin，AR)甲基化水平的紊亂，我們前期的研究也表明LHCGR基因甲基化異常與多囊卵巢綜合征之間的關系。在既有的一項研究中，人們并未發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征患者與匹配的對照之間外周血中總體甲基化水平的區(qū)別。綜上，針對多囊卵巢綜合征進行表觀基因組水平的DNA甲基化的關聯(lián)分析是十分有必要的。
　　目

26、的:
　　在本部分研究中，我們將使用Illumina公司的Infinium Human Methylation 450 Beadchip來進行全基因組的DNA甲基化水平的分析，具體來說，將檢測超過470，000個CpG位點，覆蓋99％的RefSeq基因，通過實驗，我們將評價外周血基因組甲基化水平與多囊卵巢綜合征之間的關系。
　　方法:
　　我們收集了300名多囊卵巢綜合征病人以及300名對照正常人的外周血，并提取DNA

27、。將每100份多囊卵巢綜合征或者正常對照標本分別等量混合為一份。然后再將這些DNA混合液進行重亞硫酸鹽轉化，后以Illumina Human Methylation 450 Bead Chip芯片進行全基因組的DNA甲基化水平檢測。對于芯片結果，采用重亞硫酸鹽測序的方法對個別位點(IGF1R，UGR2b17，TNFα)進行重復驗證。根據芯片結果的Diffscore值確定差異位點。基因注釋以及通路富集度的分析采用Database for

28、Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)實現(xiàn)。
　　結果:
　　Illumina Human Methylation 450 Bead Chip檢測了超過450，000個位點，發(fā)現(xiàn)了375個差異化的甲基化CpG位點，其中110個呈現(xiàn)低甲基化，而265個位點呈現(xiàn)高甲基化水平，多數基因處于CpG島(island)，岸(shore)或者架(shelf)上，37