多囊卵巢綜合征患者卵泡輸出率及顆粒細(xì)胞全基因組甲基化研究.pdf

1、一、卵泡輸出率對多囊卵巢綜合征患者助孕結(jié)局的預(yù)測作用
　　研究目的：
　　探討卵泡輸出率(FORT)在評價PCOS患者的卵巢反應(yīng)性、卵子發(fā)育潛能及預(yù)測妊娠結(jié)局的實際意義和應(yīng)用價值，BMI與FORT的相關(guān)性以及對其影響作用。
　　研究方法：
　　回顧性分析鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2013年1月至2014年12月間行體外受精-胚胎移植治療的5477個周期患者病歷資料，其中多囊卵巢綜合征患者612例，非多囊卵巢

2、綜合征患者4865例。按照妊娠與非妊娠對PCOS和非PCOS患者進(jìn)行分組分別對比不同組間的年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH/LH比值、FORT、Gn天數(shù)、Gn總量、獲卵數(shù)、2PN受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、移植胚胎數(shù)、胚胎總數(shù)等指標(biāo)。再按照 FORT低、中、高分組對比年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH/LH比值、Gn天數(shù)、Gn總量、獲卵數(shù)、2PN受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、移植胚胎數(shù)、胚胎總數(shù)、妊娠率等指標(biāo)。繪制BMI與FORT相關(guān)性的散點圖分析。<

3、br>　　結(jié)果：
　　1．在 PCOS患者中妊娠組與未妊娠組對比，年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH/LH比值、FORT、Gn天數(shù)、Gn總量、獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)、胚胎總數(shù)等均無顯著差異(P＞0.05)；但妊娠組的2PN受精率(68.70％VS66.40%)、優(yōu)質(zhì)胚胎率(70.56%VS65.83%)顯著高于未妊娠組(P＜0.05)。
　　2．而在PCOS患者按照FORT低、中、高分組對比中，年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH

4、/LH比值、Gn天數(shù)、Gn總量、移植胚胎數(shù)、2PN受精率等均無顯著差異(P＞0.05)；而獲卵數(shù)、胚胎總數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率在低 FORT組均顯著低于中、高 FORT組(P＜0.05)；妊娠率隨 FORT低、中、高組逐漸升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3．在非 PCOS患者中妊娠組與未妊娠組對比，年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ) FSH/LH比值、移植胚胎數(shù)、2PN受精率等均無顯著差異(P＞0.05)；但妊娠組的竇卵泡計數(shù)、Gn天數(shù)、Gn總量顯

5、著低于未妊娠組(P＜0.05)；但妊娠組的FORT、獲卵數(shù)、胚胎總數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率等都顯著高于未妊娠組(P＜0.05)。
　　4．而在非PCOS患者按照FORT低、中、高分組對比中，年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH/LH比值、Gn天數(shù)、移植胚胎數(shù)、2PN受精率等均無顯著差異(P＞0.05)；而竇卵泡計數(shù)、Gn總量隨FORT低、中、高組逐漸顯著降低(P＜0.05)；成熟卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、胚胎總數(shù)隨FORT低、中、高組逐漸顯著升高(P＜

6、0.05)；在高 FORT組中優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于低、中 FORT組(P＜0.05)；臨床妊娠率在低FORT組均顯著低于中、高FORT組(P＜0.05)。
　　5．無論在PCOS患者或者是在非PCOS患者中超重組和正常BMI組的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH/LH比值、移植胚胎數(shù)均無顯著差異(P＞0.05)；但正常BMI組的Gn天數(shù)、Gn總量顯著低于超重組(P＜0.05)；而PCOS患者中正常BMI組的獲卵數(shù)、胚胎總數(shù)、臨床妊娠率均高于

7、超重組，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義，在非PCOS患者中這些指標(biāo)的差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　6．通過對BMI于FORT兩個指標(biāo)數(shù)據(jù)制作散點圖，得R2=0.003。
　　結(jié)論：
　　1．FORT值是PCOS、非PCOS患者卵巢反應(yīng)性、胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測指標(biāo)。
　　2．PCOS患者控制中等水平的FORT值可獲得較好的妊娠結(jié)局。
　　3．超重患者，控制BMI至正常水平，可有效改善IVF/ICSI妊娠結(jié)局。

8、>　　4．BMI與FORT之間不存在相關(guān)性。
　　二、多囊卵巢綜合征患者顆粒細(xì)胞NPPC基因甲基化的研究
　　研究目的：
　　分析正常人群和PCOS人群顆粒細(xì)胞NPPC基因啟動子甲基化狀態(tài)，探討在體環(huán)境下影響減數(shù)分裂的NPPC/NPR系統(tǒng)表達(dá)的相關(guān)因素。
　　研究方法：
　　選取2014年8月-2014年10月間在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF-ET治療的患者作為研究對象。嚴(yán)格篩選6例正常病例作為

9、對照組，選取6例PCOS病例作為觀察組。同時收集患者取卵日的壁層顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞，提取細(xì)胞的DNA，采用重亞硫酸氫鹽處理后測序法檢測分析NPPC基因啟動子區(qū)域DNA甲基化水平。
　　結(jié)果：
　　NPPC基因啟動子區(qū)共有23個CpG位點，分析各個樣本數(shù)據(jù)及分組數(shù)據(jù)顯示PCOS組壁層顆粒細(xì)胞NPPC基因啟動子區(qū)甲基化率為1.81±0.89%，PCOS組卵丘顆粒細(xì)胞NPPC基因啟動子區(qū)甲基化率為0.91±0.45%，對照組患

10、者壁層顆粒細(xì)胞 NPPC基因啟動子區(qū)甲基化率為0.73±0.56%，對照組卵丘顆粒細(xì)胞NPPC基因啟動子區(qū)甲基化率為0.55±0.60%。四組均為低甲基化水平，且兩兩配對組間對比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(T=83.5,P=0.15)。在PCOS組中CpG位點2、6、7、11、12、13、15、16、18、19、20、23均出現(xiàn)甲基化，而在對照組中 CpG位點3、6、7、9、10、14、16均出現(xiàn)甲基化，但亦均處于低甲基化水平，且整體無顯著差異。

11、
　　結(jié)論：
　　PCOS患者NPPC基因啟動子區(qū)域甲基化水平與對照組比較無差異，均呈低甲基化水平?？赡艽嬖谄渌恼{(diào)控機制來調(diào)節(jié)NPPC基因的表達(dá)。
　　三、多囊卵巢綜合征患者顆粒細(xì)胞全基因組甲基化分析
　　研究目的：
　　本研究擬通過甲基化高密度芯片對PCOS患者卵泡壁層顆粒細(xì)胞中的全基因組甲基化進(jìn)行分析，篩查PCOS患者與正常對照人群間的甲基化差異位點及甲基化差異表達(dá)的基因，同時通過生物信息學(xué)的分析精確

12、的查出與之相關(guān)細(xì)胞通路。建立DNA甲基化譜，分析DNA甲基化異常與PCOS不同臨床病理特征間的相關(guān)性。為進(jìn)一步尋找PCOS發(fā)生發(fā)展的表觀遺傳分子機制、以及疾病的早期診斷、判斷預(yù)后的分子生物學(xué)指標(biāo)奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　選取2014年8月-2014年10月間在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF-ET治療的患者作為研究對象。嚴(yán)格篩選40例正常病例作為對照組，選取40例PCOS病例作為觀察組。收集患者取卵日的壁層顆粒

13、細(xì)胞，提取細(xì)胞的DNA，采用BSP處理后，先對樣本整體甲基化水平和羥甲基化水平分析比對，再應(yīng)用高通量芯片對樣本進(jìn)行掃描分析。芯片經(jīng)iSCan掃描后，使用GenomeStudio軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換與歸一化，以有效消除實驗過程中芯片系統(tǒng)變異對結(jié)果帶來的影響，計算被甲基化位點密度與總體CpG位點密度的比值來檢測樣品中甲基化水平。質(zhì)控數(shù)據(jù)合格進(jìn)行后期分析，通過DAVID數(shù)據(jù)庫對芯片結(jié)果進(jìn)行GO分析來比對甲基化差異位點及甲基化差異表達(dá)基因的分布，

14、應(yīng)用KEGG對比分析甲基化差異表達(dá)基因涉及的信號通路。
　　結(jié)果：
　　1．PCOS組整體甲基化差異水平顯著高于對照組，而PCOS組羥甲基化整體差異水平與對照組羥甲基化差異水平無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2．?dāng)?shù)據(jù)質(zhì)控分析顯示組間數(shù)據(jù)分布一致性較高。對差異甲基化位點進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類分析。分析結(jié)果顯示同類樣本能夠很好的分布在同一個簇中，組與組之間有較好的可比性。
　　3．通過甲基化差異位點的分析，得到各組間甲基化差異的Cp

15、G位點在CpG區(qū)域分布上、每條染色體上、基因結(jié)構(gòu)上分布。PCOS肥胖組與對照組相比發(fā)現(xiàn)6936個差異的甲基化位點，PCOS正常BMI組與對照組相比找到11245個差異的甲基化位點，PCOS正常BMI組與PCOS肥胖組相比找到5202個差異的甲基化位點。PCOS正常BMI組和PCOS組肥胖組在CpG island區(qū)差異的甲基化位點顯著多于正常對照組。
　　4．通過GO分析，可以觀察到與對照組相比PCOS肥胖人群甲基化差異顯著的基因涉

16、及到 RNA代謝過程的調(diào)控，DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，細(xì)胞成分、結(jié)構(gòu)及其各部形態(tài)學(xué)的控制等。與對照組相比BMI正常的PCOS人群甲基化差異顯著的基因涉及到轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控，DNA依賴的負(fù)向轉(zhuǎn)錄調(diào)控，胚胎的形態(tài)發(fā)生，堿基、核苷、核苷酸的代謝調(diào)控，RNA多聚酶II啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，RNA代謝的調(diào)控。BMI正常的PCOS人群與PCOS肥胖人群甲基化差異顯著的基因涉及到DNA及特殊序列DNA的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子的激活，生長因子的結(jié)合，配體依賴核受體激活

17、，核苷酸磷酸二酯酶、酪氨酸激酶蛋白、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶的激活。
　　5．通過對樣本全基因組CpG位點數(shù)據(jù)的分析，對比KEGG數(shù)據(jù)庫信息，統(tǒng)計計算出差異基因密切相關(guān)的Pathway。涉及到的信號通路包括與神經(jīng)營養(yǎng)因子有關(guān)的MAPK通路、PI-3激酶通路、PLC通路；與皮膚癌、皮膚黑色素生成有關(guān)的通路；與細(xì)胞的增殖、分化、極性調(diào)控有關(guān)的通路；與 P53基因有關(guān)的DNA損傷、氧化應(yīng)激和激活癌基因的相關(guān)通路。
　　結(jié)論：