內(nèi)分泌干擾物雙酚A及DNA甲基化致多囊卵巢綜合征高雄發(fā)生的機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 雙酚A與多囊卵巢綜合征高雄癥的發(fā)生
　　目的:明確多囊卵巢綜合征(PCOS)患者卵巢微環(huán)境雙酚A(BPA)的含量，闡明其與卵泡液中高雄之間的關(guān)系;研究BPA誘導(dǎo)的大鼠模型成年后其PCOS表型尤其是高雄的發(fā)生，明確BPA與高雄癥發(fā)生的關(guān)系。
　　材料與方法:回顧性分析2005年1月-2012年6月于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖中心行體外受精(IVF)治療的PCOS患者及因

2、輸卵管因素不孕行IVF治療患者的臨床資料，比較兩組間的臨床特點(diǎn)及妊娠結(jié)局;招募2012年9月-2013年5月于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖中心行IVF治療的PCOS不孕患者51人（PCOS組）與輸卵管因素不孕患者49人（對(duì)照組），使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測(cè)患者卵泡液中的總睪酮(TT)，雄烯二酮(A)，性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)的含量，利用高效液相色譜

3、-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC/MS/MS)檢測(cè)卵泡液中BPA的水平。建立BPA誘導(dǎo)PCOS大鼠模型，在其第6-8周觀察其動(dòng)情周期，從而監(jiān)測(cè)排卵情況，觀察性成熟期大鼠卵巢形態(tài)，外周血中雄激素等內(nèi)分泌狀態(tài)的異常。
　　結(jié)果:PCOS組患者較對(duì)照組表現(xiàn)為內(nèi)分泌紊亂，其中最為明顯的是高雄激素狀態(tài);PCOS患者胚胎移植取消率顯著增高，臨床妊娠率顯著降低，流產(chǎn)率顯著增加。PCOS患者卵泡液中的TT，A，游離雄激素指數(shù)(FAI)與BPA水平明顯升高;且

4、在BPA較高的PCOS病人中，其卵泡液中TT，A，F(xiàn)AI含量也顯著高于非高BPA的PCOS病人;卵泡液中BPA含量與TT，A，F(xiàn)AI在所有病人，對(duì)照組及PCOS組均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系;其中PCOS組中的相關(guān)系數(shù)顯著高于對(duì)照組的相關(guān)系數(shù);BPA誘導(dǎo)的大鼠模型表現(xiàn)為持續(xù)動(dòng)情，外周血中TT，LH/FSH比值增高，卵巢發(fā)生多囊樣改變。
　　結(jié)論:PCOS患者表現(xiàn)為顯著的高雄激素狀態(tài)，其妊娠結(jié)局也明顯劣于因輸卵管因素行助孕治療的女性;PCOS患

5、者卵泡液中BPA含量顯著高于對(duì)照組，且高BPA與高雄激素狀態(tài)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系;高BPA暴露成功誘導(dǎo)大鼠發(fā)生PCOS表型。
　　第二部分 雙酚A通過雄激素受體抑制顆粒細(xì)胞中芳香化酶的轉(zhuǎn)錄及功能從而引起高雄的機(jī)制研究
　　目的:利用人原代培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞體外研究高BPA暴露與高雄發(fā)生之間的關(guān)系，并從轉(zhuǎn)錄水平闡明其中機(jī)制。
　　材料與方法:體外使用BPA刺激原代培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞，使用實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot的方

6、法檢測(cè)細(xì)胞中芳香化酶(P450)的表達(dá)，利用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中睪酮(T)、A、雌二醇(E2)及雌酮(E1)的含量以檢測(cè)P450的功能;分別進(jìn)行雌激素受體(ER)/雄激素受體(AR)阻斷實(shí)驗(yàn)和AR特異性siRNA干擾試驗(yàn)，檢測(cè)BPA影響P450可能作用的受體;利用工具細(xì)胞HEK293FT，體外過表達(dá)雄激素受體(AR)表達(dá)質(zhì)粒和帶有雄激素反應(yīng)元件（ARE）的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀及熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)研究BPA作用機(jī)制

7、，利用腺病毒AR過表達(dá)載體感染原代培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞，驗(yàn)證BPA影響顆粒細(xì)胞功能的機(jī)制。
　　結(jié)果:體外BPA刺激可濃度依賴地抑制P450的表達(dá)和功能，且該抑制作用可以被AR阻斷劑flutamide及AR-siRNA所阻斷。體外熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)BPA可以濃度依賴地抑制T所誘導(dǎo)ARE下游的熒光素酶表達(dá)，染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)BPA并不影響AR的轉(zhuǎn)錄活性，但是BPA可以濃度依賴地抑制T激活的AR轉(zhuǎn)錄及下游芳香化酶的轉(zhuǎn)錄。
　　

8、結(jié)論:卵巢高BPA水平可抑制P450轉(zhuǎn)錄及功能，從而雄激素代謝障礙，最終引起PCOS高雄的發(fā)生;BPA通過干擾雄激素誘導(dǎo)的AR轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制P450的轉(zhuǎn)錄。
　　第三部分 高BPA暴露引起顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組改變及DNA甲基化異常在高雄發(fā)生的機(jī)制研究
　　目的:明確高BPA暴露的顆粒細(xì)胞中基因的差異表達(dá)，及涉及的相關(guān)通路和功能;在PCOS病人的顆粒細(xì)胞中驗(yàn)證與甾體激素合成及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果是否一致;檢測(cè)PCO

9、S顆粒細(xì)胞中整體甲基化程度的改變及與甾體激素合成相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化修飾異常，揭示異常甲基化在PCOS高雄發(fā)生中的作用。
　　材料與方法:使用Illumina Hiseq2000分別針對(duì)3名卵泡液中高BPA水平的PCOS患者及對(duì)照組的顆粒細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并進(jìn)行下游的生物信息學(xué)分析;共招募PCOS不孕患者71人與輸卵管因素不孕患者50人，收集其卵泡液，顆粒細(xì)胞。使用ELISA測(cè)定其卵泡液中TT，SHBG，F(xiàn)AI含量，運(yùn)用實(shí)時(shí)

10、定量PCR技術(shù)擴(kuò)大樣本量對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;針對(duì)5-甲基胞嘧啶(5-mC)含量測(cè)定兩組病人顆粒細(xì)胞中DNA整體甲基化水平;利用MassARRAYTM EpiTYPER DNA甲基化定量分析技術(shù)分析特異基因某個(gè)或某些特定CpG位點(diǎn)的甲基化水平。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比92個(gè)基因在高BPA水平的PCOS的顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)(fold change≥1.5，P＜0.05，false discovery rate＜0.0

11、5);針對(duì)此92個(gè)差異基因的生物信息學(xué)分析得到這些差異基因主要與免疫炎癥疾病，生殖系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，代謝性疾病相關(guān);涉及的功能主要有細(xì)胞死亡和存活，細(xì)胞間通訊，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，脂質(zhì)代謝等相關(guān);涉及心血管系統(tǒng)、胚胎、內(nèi)分泌系統(tǒng)等的發(fā)育和功能;下游的分析發(fā)現(xiàn)甾體激素的合成及脂質(zhì)代謝功能受激活。實(shí)時(shí)定量PCR與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致;PCOS病人的顆粒細(xì)胞的DNA整體甲基化水平顯著降低（4.44±0.65％ vs.6.07±0.72％，P＜0.

12、05）;MassARRAYTM EpiTYPER DNA結(jié)果顯示有差異的與甾體激素合成及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因特定甲基化位點(diǎn)的甲基化程度呈現(xiàn)不同程度的降低，并與基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)不同程度的負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:高BPA暴露的顆粒細(xì)中甾體激素的合成功能顯著激活，提示與高雄激素血癥的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān);總體水平或基因特異性的DNA異常甲基化可部分解釋PCOS病人顆粒細(xì)胞異常的基因表達(dá)以及隨之而來的高雄。我們的結(jié)果提示DNA異常甲基化可能是PCO