檢測DNA甲基化新型微陣列芯片研究.pdf

1、DNA甲基化是～種重要的表觀遺傳學修飾，在過去的10年，DNA甲基化研究領域快速發(fā)展并成為分子遺傳學的一個重要分支。DNA甲基化參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，X染色體失活，發(fā)育調(diào)控和細胞分化。異常的DNA甲基化與癌癥及許多其他疾病的發(fā)生密切相關(guān)。然而，目前對于DNA甲基化在人類基因組中的認識十分有限。一定程度上說缺少高通量的研究技術(shù)是阻礙基因組水平研究DNA甲基化功能的關(guān)鍵原因。基因芯片由于其極高的檢測通量，在基因組學、藥物學、醫(yī)學檢驗等領域中得

2、到了越來越廣泛的關(guān)注。本論文DNA甲基化為研究對象，從探針設計、DNA模板制備、甲基化特異識別分子和檢測方式等多種角度，提出一系列創(chuàng)新性思路與方法，設計新型的檢測DNA甲基化微陣列芯片，并利用這些芯片檢測技術(shù)，開展了對腫瘤細胞系和癌癥樣本的甲基化研究，這些技術(shù)包括：用于測定多個特定CpG位點的單堿基單熒光延伸檢測DNA甲基化技術(shù)和單堿基雙熒光檢測DNA甲基化技術(shù)，用于測定CpG島密度的基于通用靶標序列微陣列的CpG島高甲基化測定技術(shù)、基

3、于滾環(huán)擴增檢測CpG島高甲基化檢測技術(shù)、利用甲基化結(jié)合蛋白測定DNA甲基化密度的方法以及不只是限于甲基化測定的基于硫代保護的DNA測序技術(shù)。具體內(nèi)容如下：
　　 1.單堿基單熒光延伸檢測DNA甲基化技術(shù)
　　 我們以p16和E-cad基因啟動子區(qū)的CpG島為研究對象，針對要檢測的CpG位點，設計一對5′末端為氨基，3′末端堿基為C或T，特異識別亞硫酸氫鹽反轉(zhuǎn)后甲基化與非甲基化變化的探針，探針對的數(shù)量與要研究的目的片段中C

4、pG位點數(shù)量一致，并將這些探針對點樣于醛基片上構(gòu)建微陣列。將10例乳腺癌細胞系和2例正常人外周血細胞DNA用亞硫酸氫鹽處理，經(jīng)過PCR擴增后，得到雙鏈DNA片段，其中非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)，甲基化胞嘧啶經(jīng)過擴增后轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆奏?C)，再將PCR產(chǎn)物用外切酶處理成為單鏈，將單鏈化模板與探針對微陣列進行雜交并在片延伸帶有熒光標記的dGTP，由延伸信號的強弱可以清楚準確的識別模板中的甲基化狀態(tài)。
　　 為了能夠同時得

5、到樣本中特定CpG位點甲基化與非甲基化的信息，我們使用兩種不同的熒光標記物(Cy3-dUTP和Cy5-dCTP)并設計了一種新穎的探針分子，其結(jié)構(gòu)包含兩個部分：靠近5′端部分為唯一性序列標簽，靠近3′端部分為位點特異性序列，該位點特異性序列識別的是緊挨著某一特定CpG位點的3′端序列，并將可能覆蓋到的其他CpG位點做簡并處理。將氨基標記的與唯一性序列標簽互補的靶標點樣于醛基片上構(gòu)建微陣列。我們以p16和E-cad基因啟動子區(qū)的CpG島為

6、研究對象，將5例乳腺癌細胞系DNA和8例未經(jīng)放療或化療的乳腺癌及相應癌旁組織樣本DNA進行亞硫酸氫鹽反轉(zhuǎn)，保留甲基化信息；PCR擴增出目的片段與帶有唯一性序列標簽的位點特異性探針雜交，延伸單個帶有熒光標記的堿基(Cy3-dUTP或Cy5-dCTP)，最后與靶標微陣列雜交，Cy3信號強度代表CpG位點的非甲基化程度，Cy5則代表同一位點的甲基化程度。
　　 3.基于通用靶標序列微陣列的CpG島高甲基化測定技術(shù)
　　 除了特

7、定CpG位點的甲基化信息，不同基因CpG島的整體甲基化狀態(tài)更利于臨床性研究與診斷。本技術(shù)所使用的帶有唯一性序列標簽的序列特異性探針其序列特異性部分識別的不再是某個特定的CpG位點，而是特定的CpG島片段，與唯一性序列標簽對應的靶標，其規(guī)?？梢愿鶕?jù)研究需要加以擴大或減少，由于標簽和靶標與研究對象、研究目的沒有相關(guān)性，使得該技術(shù)更具通用性。該技術(shù)一種分析CpG島高甲基化狀態(tài)的半定量技術(shù)，我們以16個基因的64個CpG島為測定對象，將33例樣

8、本的基因組DNA經(jīng)過MseⅠ酶切，割膠獲取適當?shù)膮^(qū)域，將純化后的酶切片段連接上公共的連接子，連接后的片段用甲基化敏感性酶HpaⅡ和HhaⅠ保留高甲基化信息，然后進行Linker-PCR，擴增產(chǎn)物與帶有唯一性序列標簽的序列特異性探針雜交并延伸出熒光信號；延伸產(chǎn)物與通用靶標微陣列雜交進行信號掃描，并與標準曲線比較，判斷甲基化程度的高低。
　　 4.基于滾環(huán)擴增檢測CpG島高甲基化檢測技術(shù)
　　 除了從設計新型探針角度出發(fā)構(gòu)建

9、DNA甲基化測定芯片之外，我們還研究了利用滾環(huán)擴增制備用于甲基化測定的全基因組模板的可行性。進行滾環(huán)擴增的前提是制備環(huán)狀的模板，我們設計了一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)的連接子，成功的制備出了啞鈴狀環(huán)狀DNA模板。我們以p16基因啟動子區(qū)CpG島片段為檢測對象，分析了12例肝癌細胞系基因組DNA滾環(huán)擴增結(jié)果?；蚪M模板先用Tsp509I酶進行酶切，保留了大部分CpG島的完整；酶切片段與發(fā)卡結(jié)構(gòu)的連接子連接，形成啞鈴狀環(huán)狀分子；用甲基化敏感酶Hpa Ⅱ保留

10、高甲基化片段，用兩種外切酶，Lambda外切酶和Exonuclease Ⅰ，去除非環(huán)狀分子，加入Phi29DNA聚合酶進行滾環(huán)擴增，擴增產(chǎn)物固定在尼龍膜上，與地高辛標記的探針進行雜交，最后用化學發(fā)光檢測技術(shù)成功獲得甲基化信息。
　　 5.利用甲基化結(jié)合蛋白測定DNA甲基化密度的方法
　　 通常用于甲基化檢測的標記分子是核苷酸單體，其上標記著放射性同位素、熒光、生物素等；此外還有識別甲基化胞嘧啶的抗體以及甲基供體。本方法將

11、甲基化結(jié)合蛋白(HMBD)與熒光分子相偶聯(lián)，利用這種標記分子構(gòu)建了一種檢測DNA甲基化密度的微陣列芯片。甲基化結(jié)合蛋白能購識別甲基化的CpG二聯(lián)體，為了區(qū)分目標序列中CpG位點的甲基化和非甲基化狀態(tài)，我們首先將7例肝癌細胞系和2例正常人外周血樣本基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理，利用PCR擴增，獲得6種不同CpG島片段產(chǎn)物，將擴增后的帶氨基標記的PCR產(chǎn)物固定在醛基片上，構(gòu)建微陣列芯片，用甲基化轉(zhuǎn)移酶SssⅠ將芯片上PCR產(chǎn)物中的所有Cp

12、G位點甲基化，用末端轉(zhuǎn)移酶TdT將TAMRA-dUTP轉(zhuǎn)移到固定在基片上的PCR產(chǎn)物末端，用TAMRA的量表示固定PCR產(chǎn)物的量，將基片與Cy5-HMBD蛋白孵育，Cy5熒光強度表示甲基化位點的數(shù)量；根據(jù)標準曲線，Cy5/TAMRA的比值表示目標區(qū)域中甲基化CpG的密度。
　　 6.基于硫代保護的DNA測序技術(shù)
　　 DNA測序技術(shù)具有廣闊的應用前景，其應用范圍不僅限于甲基化研究，國內(nèi)目前尚未發(fā)展出可以與Solexa和S

13、olid技術(shù)相媲美的測序方法。我們希望發(fā)展出擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的測序技術(shù)，由此我們提出了基于硫代保護的DNA測序技術(shù)原型，并對其進行了可行性研究，該技術(shù)主要利用外切酶Ⅲ對雙鏈DNA具有特異性的3′→5′外切活性，而硫代核苷鍵對外切酶Ⅲ的外切活性具有拮抗作用的特性。我們以T7噬菌體基因組DNA為模板，將其超聲破碎后進行環(huán)化，環(huán)化基因組片段模板在乳液液滴中得以單克隆擴增，將擴增產(chǎn)物固定在固相基底上，變性去除互補鏈之后，雜交上硫代修飾的測序引物

14、；用含有單一已知核苷酸單體混合物（熒光標記的與正常的核苷酸單體）的延伸反應溶液進行延伸反應，此時，形成的是正常的核苷鍵；延伸上的熒光堿基通過外切酶Ⅲ的3′-→5′外切活性去除；然后延伸具有與已知核苷酸相同類型的硫代核苷酸單體，使之形成硫代核苷鍵，拮抗下一次的酶切反應，確保引物進一步向前延伸，用含第二種己知核苷酸單體的延伸反應溶液進行延伸反應，重復之前的步驟。根據(jù)堿基互補配對原則，只有加入的核苷酸單體與緊接著延伸的模板上的堿基相互配對，延