脈沖超聲聯(lián)合微泡對在體不同級別微血管損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　超聲波既可以用于人體疾病的診斷，又可作為一種能量形式用于疾病的治療。超聲造影劑是一種由氣體填充，脂質(zhì)體或蛋白質(zhì)包裹的微泡（一般直徑在1-10μm）。微泡能有效地增強(qiáng)心肌、肝、腎、腦等實(shí)質(zhì)器官的二維灰階和多普勒血流信號，可監(jiān)測器官內(nèi)的血流灌注情況，明顯提高超聲診斷的敏感性和特異性，已在臨床得到廣泛應(yīng)用。診斷超聲（2.3MHz，MI值為0.4）聯(lián)合微泡對細(xì)胞也有一定的損傷作用，會引起紅細(xì)胞外滲以及細(xì)胞死亡。這個結(jié)果明確顯示

2、了診斷超聲聯(lián)合微泡的生物效應(yīng)，雖然對活體的參數(shù)設(shè)定不是很明確。超聲聯(lián)合微泡的治療雖然仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，但其臨床應(yīng)用潛力巨大，是近幾年超聲醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。微泡經(jīng)靜脈注入血管后，由于微泡直徑的限制，難以滲透到組織間隙，其治療效應(yīng)主要作用于血管壁。超聲聯(lián)合微泡對正常微小血管的損傷作用主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)改變、壞死和脫落，基底膜斷裂和小動靜脈內(nèi)血栓形成等。超聲聯(lián)合微泡技術(shù)已用于基因治療、溶栓治療、藥物輸送、腫瘤物理治療、創(chuàng)傷止血、干細(xì)胞移

3、植等方面的實(shí)驗(yàn)研究。
　　超聲聯(lián)合微泡既可以斷開細(xì)胞間緊密的連接，也可以增加物質(zhì)的跨細(xì)胞運(yùn)輸，空化效應(yīng)是其主要機(jī)制。在不同條件下，其對血管的損傷程度不同，頻率為1MHz，聲壓為0.8MPa時會產(chǎn)生血管炎癥，而聲壓為2.0MPa時則有明顯的血管內(nèi)皮損傷。在超聲的作用下，微泡振蕩產(chǎn)生的微流、周期性的收縮與膨脹產(chǎn)生的作用力以及微泡破裂產(chǎn)生的微射流作用可對附近的血管壁產(chǎn)生輕微損傷,這種損傷在一定程度上增加了血管的通透性。超聲生物學(xué)效應(yīng)可改

4、變細(xì)胞膜通透性，有利于藥物/基因的跨胞膜遞送。
　　超聲聯(lián)合微泡在基因治療方面的研究發(fā)展迅速，主要應(yīng)用于皮膚、心臟、胰腺、腎臟、骨骼肌以及腫瘤組織?；蜣D(zhuǎn)染或藥物傳輸?shù)淖罴褩l件是能最大限度地增加細(xì)胞膜通透性，又不造成細(xì)胞膜的不可逆損傷，且超聲輻照攜帶基因或載藥微泡，廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文
　　可靶向特異組織釋放出基因或藥物。低頻超聲可增強(qiáng)藥物的經(jīng)皮滲透，主要機(jī)制是超聲作用于皮膚間的本身存在的空泡，產(chǎn)生空化效應(yīng)，使細(xì)胞間產(chǎn)生

5、空隙，皮膚上皮層分散，從而使小分子藥物通過。
　　超聲聯(lián)合微泡對血管可以產(chǎn)生嚴(yán)重或不可逆性的損傷作用。血管毀損術(shù)(Angiotripsy)是指將微泡造影劑注入靜脈，在較低的平均聲強(qiáng)下進(jìn)行超聲輻照，對微血管產(chǎn)生一定的損毀作用，而治療區(qū)域沒有明顯的熱效應(yīng)。微泡經(jīng)靜脈注入血管后，由于微泡直徑的限制，難以滲透到組織間隙，損傷作用主要發(fā)生在微小血管，超聲輻照區(qū)域的微血管破壞，使組織局部微循環(huán)血供停止而達(dá)到治療的目的。以上述研究為基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)

6、研究在一定治療參數(shù)下對腸壁及腸系膜不同內(nèi)徑血管損傷程度的不同。
　　目的：
　　超聲聯(lián)合微泡誘發(fā)血管損傷在過去幾年中被廣泛研究，但機(jī)制研究較缺乏，多數(shù)是在離體細(xì)胞水平或者模擬血管，以細(xì)胞水平的研究為主。超聲聯(lián)合微泡對細(xì)胞產(chǎn)生的聲孔效應(yīng)可在細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)小孔并可測量孔徑，有研究成功將熒光分子直接通過細(xì)胞膜上形成的小孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而細(xì)胞仍可保持生物活性。這幾年隨著攝像技術(shù)的發(fā)展，使用高速攝像顯微鏡觀察單個微泡空化效應(yīng)對內(nèi)皮細(xì)胞膜的

7、損傷，從而研究超聲激勵的微泡對細(xì)胞的作用機(jī)制，研究著重在穩(wěn)態(tài)空化的作用，對于血管造成的是輕微的可逆的損傷作用。雖然先前研究結(jié)果顯示，超聲聯(lián)合微泡對血管的嚴(yán)重?fù)p傷在腫瘤治療、實(shí)質(zhì)臟器的創(chuàng)傷止血等方面具有較好的應(yīng)用前景，但沒有實(shí)時觀察對在體血管的損傷過程，對血管損傷的機(jī)制方面也缺乏研究。本文主要研究超聲聯(lián)合微泡在體腸壁上的毛細(xì)血管及腸系膜動靜脈微血管的損傷作用，并且對血管損傷程度進(jìn)行分類，更直觀的觀察低頻高負(fù)值峰壓超聲誘導(dǎo)微泡對在體微血管的

8、直接損傷作用。
　　方法：
　　健康新西蘭大白兔20只，質(zhì)量約2.0-2.5kg。所有實(shí)驗(yàn)大白兔術(shù)前禁食12h，可自由飲水。將其中2只大白兔設(shè)為空白組，余18只設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔先使用速眠新Ⅱ注射液（由吉林省敦化市圣達(dá)動物藥品有限公司生產(chǎn)）0.2ml/kg進(jìn)行肌肉注射，等待兔子初步麻醉后，使用21G針管插入實(shí)驗(yàn)兔左耳的耳緣靜脈建立靜脈通道，使用2.5％戊巴比妥鈉（1.0ml/kg）麻醉。
　　室溫保持恒定，

9、濕度在40-60%之間，并且維持動物在深度麻醉下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)兔仰臥位固定后，中下腹備皮，沿腹白線開腹，將部分小腸拉出體外，兔子側(cè)臥位擺放，選擇一段腸系膜血管進(jìn)入腸壁分支較多的腸管（大約5cm）固定，腸管內(nèi)注入脫氣水（水域溫度37℃），使用顯微鏡（Olympus IX71倒置熒光顯微鏡——日本Olmpus公司）觀察治療前血管形態(tài)，記錄并將中心區(qū)域觀察血管做標(biāo)記；然后將固定腸管放入注滿脫氣水的容器中。抽取脂氟顯微泡懸液0.2ml/kg，加

10、入生理鹽水稀釋至4ml，5min內(nèi)經(jīng)靜脈通道緩慢勻速注入。實(shí)驗(yàn)組同時用超聲治療儀輻照之前觀察并標(biāo)記的腸壁及腸系膜血管區(qū)域5 min，空白組假照目標(biāo)腸壁及腸系膜5min。治療結(jié)束后，使用顯微鏡再次觀察標(biāo)記血管，并記錄。然后經(jīng)耳緣靜脈注入伊文思藍(lán)溶液（2%）5ml，觀察伊文思藍(lán)在目標(biāo)血管內(nèi)的灌注情況，并記錄。
　　血管分級：腸壁血管肉眼下可見，由于治療后，腸壁透光變差，且部分血管變形，內(nèi)徑測量不準(zhǔn)確，所以在治療前使用顯微鏡放大40倍觀

11、察血管，可以明確觀察到腸系膜血管進(jìn)入腸壁后每一級血管，并將血管分級。第一級：內(nèi)徑>100μm的血管，這級血管包含腸系膜血管，以及部分腸壁血管；第二級內(nèi)徑60-100μm的血管；第三級30-60μm；第四級10-30μm，這級血管為微小動、靜脈血管；第五級為<10μm的毛細(xì)血管網(wǎng)。在治療后再次用顯微鏡觀察治療區(qū)域，并統(tǒng)計(jì)出不同級別的動靜脈血管的損傷程度的不同。由于在顯微鏡視野下毛細(xì)血管呈網(wǎng)狀分布，難以計(jì)數(shù)，未計(jì)入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，故僅觀察超聲作

12、用下毛細(xì)血管的形態(tài)學(xué)改變。
　　損傷程度分級：損傷照程度由低到高分為四級，第一級血管周圍未見滲出，即在治療后血管未觀察到明顯的變化以及滲出；第二級血管周圍可見少量滲出，未形成血腫，在伊文思藍(lán)灌注后血管邊界模糊；第三級為血管周圍可見大量滲出并形成血腫；第四級是血管血流阻斷，即在靜脈注入伊文思藍(lán)后血管血流阻斷，遠(yuǎn)端血管未見伊文思藍(lán)灌注，或者毛細(xì)血管可見紅藍(lán)分界。
　　病理學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用戊巴比妥鈉(2.5%)10ml/k

13、g靜脈推注進(jìn)行過量麻醉安樂死，立即切取治療中心的腸壁組織，置于10%福爾馬林溶液固定1d，經(jīng)脫水、石蠟包埋及蘇木素伊蘭（HE）染色等程序后，連續(xù)切片制成病理切面，顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)組共18只兔，每只兔均對治療區(qū)域內(nèi)的一至四級血管進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，第五級血管（毛細(xì)血管）因計(jì)數(shù)困難而僅對損傷程度進(jìn)行描述。一、二級廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文
　　血管均記錄3條動脈和3條靜脈血管，根據(jù)血管內(nèi)徑的不同，1-2級血

14、管每級動、靜脈血管數(shù)量各54條。第三級血管（30-60微米）在視野下可觀察到清晰的分叉，動靜脈血管各62支，第四級血管在視野下由第三級血管主干分叉出，血管清晰，長度大于100微米，符合第四級血管（10-30微米）要求的血管計(jì)數(shù)為96支動脈及102支靜脈。各組別之間損傷程度的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件。
　　結(jié)果：
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果:
　　不同組動/靜脈血管兩兩比較：

15、r>　　01組>100μm VS60-100μm、02組>100μm VS30-60μm、03組>100μm VS10-30μm、04組60-100μm VS30-60μm、05組60-100μm VS10-30μm、06組30-60μm VS10-30μm
　　以上6組所得P值均小于0.05，說明兩兩之間在血管損傷中的頻數(shù)分布不同。第1-4級血管類型中：阻斷的發(fā)生率最高的是第四級（10-30μm）動/靜脈血管。大量滲出的發(fā)生率最

16、高的是第三級（30-60μm）動/靜脈血管；少量滲出的發(fā)生率最高的是第二級（60-100μm）動/靜脈血管；未見明顯損傷的發(fā)生率最高的是第一級（>100μm）的動/靜脈血管。
　　第五級血管毛細(xì)血管，在顯微鏡下放大100倍下觀察，取毛細(xì)血管顯示清晰且較均勻分布而少大血管的區(qū)域，一個視野內(nèi)的毛細(xì)血管分布區(qū)域分為36×48個小格，觀察其中滲出所占格數(shù)，得到毛細(xì)血管滲出面積為（4.3±1.7）%。在顯微鏡下放大200倍觀察毛細(xì)血管管壁較

17、薄，可觀察到部分毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞的流動，在注入伊文思藍(lán)后，多個被阻斷的毛細(xì)血管出現(xiàn)明顯的紅藍(lán)交界。
　　血管形態(tài)改變：治療后可見血管發(fā)生明顯的變形。有的血管內(nèi)徑發(fā)生變化，部分動脈血管內(nèi)徑比治療前增寬；部分動脈血管管壁呈波浪狀改變；有的血管走行較治療前有改變，表現(xiàn)為血管分叉處夾角增大，多出現(xiàn)在第二、三、四級血管。
　　在病理切片中，空白組各級血管管壁平整，血管周圍未見紅細(xì)胞滲出，部分血管內(nèi)可見少量紅細(xì)胞堆積，腸壁組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，

18、內(nèi)未見紅細(xì)胞溢出。治療組微動靜脈血管對比空白組可見明顯擴(kuò)張，以靜脈血管為主，擴(kuò)張血管內(nèi)可見大量紅細(xì)胞堆積，以血管分叉處為主；部分微動靜脈血管內(nèi)可見不典型性血栓，呈長條狀，貫通血管；部分血管周圍可見紅細(xì)胞溢出，血管壁內(nèi)皮細(xì)胞可見少量脫落。周圍組織腸黏膜、腸黏膜下以及肌層內(nèi)紅細(xì)胞堆積較明顯，腺體間隙偶可見微小動靜脈末端以及毛細(xì)血管。
　　結(jié)論：
　　1、超聲聯(lián)合微泡可以對腸系膜及腸壁各類型血管產(chǎn)生不同的損傷作用。
　　2、