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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
通過(guò)研究Graves病(Graves'disease,GD)患者外周血中miR-346表達(dá)水平的變化,分析miR-346與濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞(follicularhelperTcell,Tfhcell)以及病人自身抗體水平的關(guān)系,初步探討miR-346在Tfh細(xì)胞分化以及Graves病發(fā)病過(guò)程中的作用。
方法:
1.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)GD患者與健康對(duì)照外周血C
2、D4+T細(xì)胞中Bcl-6mRNA表達(dá)情況。利用miRanda和PicTar兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)軟件,預(yù)測(cè)可能調(diào)控Bcl-6的miRNAs,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)這些miRNAs在GD患者以及健康對(duì)照CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)情況,篩選出與Bcl-6mRNA表達(dá)趨勢(shì)相反的miRNA做進(jìn)一步研究。
2.利用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-346與Bcl-6的靶向作用,明確miR-346與Bcl-63'UTR的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的作用強(qiáng)度。以表達(dá)Bcl
3、-6的Jurkat細(xì)胞做為模型,轉(zhuǎn)染miR-346mimics或NC,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Jurkat細(xì)胞Bcl-6mRNA水平變化,Western-blot檢測(cè)Jurkat細(xì)胞Bcl-6蛋白水平變化。
3.磁珠分選健康人外周血CD4+T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染miR-346mimics或NC,采用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometer,FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CD4+T細(xì)胞中Tfh細(xì)胞(CD4+CXCR5+T)的比例變化。
4、 4.采用qRT-PCR檢測(cè)GD患者、治療后GD組以及健康對(duì)照者的外周血CD4+T細(xì)胞以及血漿中成熟miR-346表達(dá)情況,并進(jìn)行比較。
5.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GD患者外周血中Tfh細(xì)胞(CD4+CXCR5+T)的比例,并與CD4+T細(xì)胞以及血漿中成熟miR-346表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。同時(shí)對(duì)GD患者外周CD4+T細(xì)胞中miR-346表達(dá)水平與Bcl-6mRNA水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
6.應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫
5、分析法(chemiluminescenceimmunoassay,CIA)檢測(cè)GD患者的抗促甲狀腺激素受體抗體(anti-TSHreceptorantibody,TR-Ab)、抗甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulinantibody,TG-Ab)和抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(anti-thyroperoxidaseantibody,TPO-Ab)的水平,分析三種抗體水平分別與外周CD4+T細(xì)胞中miR-346表達(dá)水平的相關(guān)性
6、。
結(jié)果:
1.GD患者外周血CD4+T細(xì)胞中Bcl-6mRNA水平顯著升高(P<0.05)。經(jīng)過(guò)miRanda和PicTar兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)軟件的分析,取預(yù)測(cè)結(jié)果的交集,并結(jié)合文獻(xiàn)查詢結(jié)果,篩選出可能調(diào)控Bcl-6的miRNA:miR-181d,miR-20a,miR-30b,miR-346。只有miR-346在GD患者外周血CD4+T細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),與上調(diào)的Bcl-6mRNA水平趨勢(shì)相反。<
7、br> 2.熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí),miR-346通過(guò)與Bcl-6的3'UTR上第576-582位堿基及第893-899位堿基互補(bǔ)結(jié)合發(fā)揮抑制功能。miR-346單獨(dú)作用于576-582位點(diǎn)時(shí),熒光素酶活性下降約42%;單獨(dú)作用于893-899位點(diǎn)時(shí),熒光素酶活性下降約30%;同時(shí)作用于兩位點(diǎn)時(shí),熒光素酶活性下降約60%。Jurkat細(xì)胞(人白血病T細(xì)胞)自然狀態(tài)下表達(dá)Bcl-6,過(guò)表達(dá)的miR-346能夠從mRNA水平和蛋白水平抑
8、制其Bcl-6的表達(dá)。
3.與轉(zhuǎn)染NC組相比,人外周血CD4+T細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-346后,CD4+CXCR5+T細(xì)胞的比例明顯下調(diào)。
4.與健康對(duì)照組相比,GD組外周血CD4+T細(xì)胞和血漿中miR-346表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.001;P<0.001),治療后GD組外周血CD4+T細(xì)胞和血漿中miR-346表達(dá)水平有所恢復(fù)。
5.GD患者CD4+T細(xì)胞中miR-346水平與CD4+CXCR5
9、+T細(xì)胞的比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4771,P=0.0334),與Bcl-6mRNA水平也呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4558,P=0.0434)。GD患者血漿miR-346水平與外周血中CD4+CXCR5+T細(xì)胞的比例有負(fù)相關(guān)趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(r=-0.3322,P=0.1647)。
6.GD患者血清TR-Ab、TG-Ab和TPO-Ab水平分別與外周CD4+T細(xì)胞中miR-346表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4086,P=0.
10、0202;r=-0.4368,P=0.0227;r=-0.3533,P=0.0473)
結(jié)論:
1.通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)以及臨床標(biāo)本初篩,選出可能調(diào)控Tfh細(xì)胞主要轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的miRNA,miR-346;通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-346靶向作用于Bcl-6,主要作用位點(diǎn)是Bcl-63'UTR上第576-582位堿基及第893-899位堿基;使Jurkat細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-346,證實(shí)miR-346
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