骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在早期胚胎神經(jīng)管畸形部位特異性定植與HGF-MET的表達(dá)之間的關(guān)系.pdf

1、目的:
　　神經(jīng)管畸形是一種嚴(yán)重的神經(jīng)管缺陷性畸形，在世界范圍內(nèi)的發(fā)生率為0.5‰-20‰，目前還沒(méi)有有效的治療方式。近幾年采用的脊柱裂修補(bǔ)術(shù)雖然能夠減輕繼發(fā)性腦積水和改善部分下肢功能，但是對(duì)修復(fù)下肢感覺(jué)障礙，運(yùn)動(dòng)障礙及自主神經(jīng)功能障礙，例如膀胱、肛門(mén)等括約肌功能障礙導(dǎo)致的尿、便失禁等術(shù)后神經(jīng)損傷的后遺癥仍無(wú)良好效果，這是由于神經(jīng)受損后的極難修復(fù)所造成的。因此，我們課題組提出在胚胎發(fā)育早期針對(duì)神經(jīng)管畸形的神經(jīng)發(fā)育不良而進(jìn)行神經(jīng)元的

2、修復(fù)重建是提高手術(shù)治療效果的關(guān)鍵，這樣既可以治療神經(jīng)源性發(fā)育異常，又可以避免繼發(fā)性損傷。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞，具有自我增殖和分化為多種細(xì)胞的潛能，尤其是能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞，移植后的MSCs表現(xiàn)出了較好的神經(jīng)修復(fù)潛能，可在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化。
　　已有研究表明，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在MSCs治療多發(fā)性硬化癥、肝硬化、骨不連、腎小管上皮細(xì)胞缺血再灌注損傷等疾病的治療中起著重要作用，尤其是在多發(fā)性硬化癥及肝纖維化

3、的治療中更為重要。
　　我們課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，利用骨髓MSCs羊膜腔內(nèi)移植來(lái)治療早期神經(jīng)管畸形，證實(shí)了在神經(jīng)管畸形早期，羊膜腔內(nèi)注射的骨髓MSCs可以自主向胚胎神經(jīng)管畸形缺損部位特異性遷移并存活，并且發(fā)現(xiàn)MSCs自主遷移可能與神經(jīng)管畸形胚胎的體內(nèi)微環(huán)境及趨化因子有關(guān)，本研究旨在探究骨髓MSCs移植后的遷移與Hgf/Met通路的關(guān)系，為探究細(xì)胞因子與骨髓MSCs遷移的關(guān)系提供研究基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方法，為骨髓MSCs在神經(jīng)管畸形胚胎

4、中的早期治療提供基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1、骨髓MSCs分離培養(yǎng)
　　選取適齡的Wistar大鼠，體重在60g到100g，在無(wú)菌條件下取出大鼠股骨，用5ml增殖培養(yǎng)基DMEM/F12(1∶1)(含10％胎牛血清)沖洗骨髓腔，適當(dāng)吹打，做成細(xì)胞懸液，采用貼壁法分離骨髓MSCs，5％CO2，37℃孵箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
　　綠色熒光蛋白標(biāo)記骨髓MSCs，轉(zhuǎn)染腺病毒-5F35-enhanced Gene Fluore

5、scentProtein(eGFP)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及轉(zhuǎn)染率，消化，吹打，離心后制成3000-5000個(gè)/ul的細(xì)胞懸液。
　　2、動(dòng)物模型建立與羊膜腔內(nèi)MSCs注射
　　成年Wistar大鼠雌雄比例5∶1午夜合籠，次日晨8:00左右進(jìn)行陰道涂片，普通顯微鏡下發(fā)現(xiàn)精子即視為受孕，記為懷孕第0天(E0)，于孕鼠懷孕第9.5(E9.5)天或第10天(E10

6、)時(shí)對(duì)孕鼠進(jìn)行深度麻醉下剖腹取出子宮，在體式顯微鏡下分離胚胎，注意不要破壞卵黃囊膜和胎盤(pán)，進(jìn)行體外培養(yǎng)，用DMSO溶解的全反式維甲酸致畸，隨機(jī)將來(lái)自同一只孕鼠的胚胎分為正常對(duì)照組和3μM全反式維甲酸處理組，在不同O2濃度下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24h，棄掉DMSO溶解的全反式維甲酸，立即換上新鮮培養(yǎng)基。于48h后終止培養(yǎng)，取出胚胎，4％多聚甲醛固定。
　　在體外培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)(E9.5，E10，E10+12h，E10+24h)進(jìn)行羊膜腔內(nèi)注射

7、移植MSCs，使用顯微注射針在胚胎背側(cè)進(jìn)入羊膜腔，注意避開(kāi)卵黃囊血管發(fā)生部位，將0.2μl MSCs懸液或者單純培養(yǎng)基注射到胚胎的羊膜腔內(nèi)，注畢觀察羊膜腔是否充盈，如果充盈則視為成功，繼續(xù)于孵箱中培養(yǎng)至48h。
　　使用體式熒光顯微鏡觀察骨髓MSCs的定植情況并且立即采集圖像，分析骨髓MSCs的趨化規(guī)律。結(jié)束培養(yǎng)后的胚胎使用4％的多聚甲醛固定后進(jìn)行冰凍切片，放于-80℃冰箱中保存。
　　3、組織切片、細(xì)胞計(jì)數(shù)與免疫熒光染色<

8、br>　　冰凍切片:將胚胎從-80℃冰箱中取出，立即用OCT包埋，使用冰凍切片機(jī)取橫斷面連續(xù)切片，片厚20μm，在熒光顯微鏡下觀察，選取有綠色熒光蛋白表達(dá)的玻片，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　細(xì)胞計(jì)數(shù):將上述玻片于熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)。
　　免疫熒光染色:將上述冰凍切片經(jīng)甲醇二次固定，抗原熱修復(fù)，10％血清封閉，加一抗4℃過(guò)夜，加488或羅丹明標(biāo)記的熒光二抗，DAPI染核。鏡下觀察。
　　4、熒光定量PCR檢測(cè)不

9、同時(shí)間點(diǎn)移植MSCs后Hgf/Met的表達(dá)情況
　　選取經(jīng)體外培養(yǎng)48h的正常組和露腦畸形組胚胎，每組12例，提取胚胎中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用合適的引物序列，配制反應(yīng)體系，用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后采用2-△△ct法分析目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化。檢測(cè)正常組和露腦畸形組Hgf/Met的表達(dá)情況。
　　5、統(tǒng)計(jì)分析
　　數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graphpad prism5軟

10、件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P值表示統(tǒng)計(jì)差異，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、維甲酸體外誘導(dǎo)大鼠胚胎發(fā)生神經(jīng)管畸形
　　利用濃度為3μM的全反式維甲酸對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠胚胎進(jìn)行誘導(dǎo)致畸，成功誘導(dǎo)胎鼠出現(xiàn)顯性脊柱裂和露腦畸形等表型的神經(jīng)管畸形。
　　2、不同時(shí)間點(diǎn)移植的MSCs在胎鼠中的定植率
　　胚胎羊膜腔內(nèi)注射MSCs，在體外培養(yǎng)至48h后，利用熒光顯微鏡可以觀察到骨髓

11、MSCs在正常組胚胎和神經(jīng)管畸形組胚胎中都有存活。其中，在正常組胚胎中，MSCs主要在閉合完全的中后腦背部神經(jīng)管處存活，而在畸形胚胎中，MSCs主要定植部位在神經(jīng)管畸形的發(fā)生部位和中后腦背部神經(jīng)管。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MSCs在胚胎中的定植率隨著畸形程度的加重而增多。在本研究中，我們觀察了不同時(shí)間點(diǎn)注射移植對(duì)骨髓MSCs定植率的影響，結(jié)果表明，E9.5、E10在正常組和畸形組移植細(xì)胞的定植率較高，而E10+12h、E10+24h移植M

12、SCs的定植率明顯降低。
　　3、免疫熒光染色結(jié)果
　　細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示在MSCs染色中可以看出，體外培養(yǎng)的MSCs中高表達(dá)HGF，不表達(dá)MET。組織免疫熒光染色顯示在胚胎中，脊髓部位高表達(dá)MET，而不表達(dá)HGF。
　　4、熒光定量PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)移植MSCs后Hgf/Met的表達(dá)情況
　　定量PCR檢測(cè)顯示:與正常組相比，Hgf在E10時(shí)的mRNA表達(dá)水平在NTDs胚胎中升高6.636倍，(P＜0.

13、01)，E10+12h時(shí)的表達(dá)量在NTDs胚胎中升高2.99倍(P＜0.01)，E10+24h時(shí)的表達(dá)量在NTDs胚胎中升高2.04倍(P＜0.01)，在E10+48h時(shí)Hgf在畸形胚胎中的表達(dá)無(wú)差異。
　　與正常組相比，畸形組Met在E10時(shí)的mRNA表達(dá)水平在NTDs胚胎中升高2.35倍，(P＜0.05)，E10+12h時(shí)的表達(dá)量在NTDs胚胎中升高1.63倍(P＜0.05)，在E10+24h，E10+48h時(shí)Met在畸形胚胎