人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定以及干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)其重編程的研究.pdf

1、背景：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)的出現(xiàn)不僅為人體組織工程繞開了胚胎干細(xì)胞的倫理障礙,而且為干細(xì)胞的研究提供了一種新思路新材料。然而,目前iPSC技術(shù)尚不成熟,高額的費(fèi)用和極低的誘導(dǎo)成功率嚴(yán)重制約了iPSC的發(fā)展,因此尋求一種既經(jīng)濟(jì)又高效的誘導(dǎo)方法是目前亟待解決的科學(xué)難題。
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesnchymal stem cells,MSCs)是體細(xì)胞分化較低的幾類細(xì)

2、胞之一,因其橫向分化能力使其在成體干細(xì)胞的研究領(lǐng)域中備受矚目。相比其他成體細(xì)胞,MSCs具有更強(qiáng)的可塑性,因此本課題使用已有的逆轉(zhuǎn)錄病毒可能更容易將其誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞。
　　 腺病毒載體(adenovirus vector)是一種具有高效轉(zhuǎn)染能力的基因載體,因其容量大、產(chǎn)量高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于基因治療。本課題初步探索利用腺病毒載體攜帶Oct4、Sox2、K1f4、Nanog四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,能否誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行

3、重編程,探索一條高效、經(jīng)濟(jì)的iPSC誘導(dǎo)方法,為臨床應(yīng)用和細(xì)胞治療奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:1)由人臍帶中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs),于體外培養(yǎng)并鑒定。2)利用已有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)其進(jìn)行iPSC的誘導(dǎo),并鑒定其相關(guān)指標(biāo)。3)構(gòu)建嵌合型腺病毒載體Ad5/F11b,且攜帶Oct4、Sox2、K1f4、Nanog四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因。4)利用構(gòu)建好的攜帶轉(zhuǎn)錄因子基因的嵌合型腺病毒Ad5/F11b感染UCMSCs,并嘗試誘導(dǎo)出多能

4、干細(xì)胞。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1)從人臍帶中分離出間質(zhì)樣細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞周期、表面標(biāo)記、分化潛能等指標(biāo)確定其為間充質(zhì)干細(xì)胞。2)已有的逆轉(zhuǎn)錄病毒可成功將所分離的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為人胚胎干細(xì)胞(hESCs)樣克隆團(tuán)細(xì)胞,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在mRNA水平上4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均不同程度的上調(diào)表達(dá),且與hESCs相關(guān)基因的表達(dá)水平也明顯提高?？蛇M(jìn)一步檢測(cè)其生化指標(biāo)確定是否為iPSC。3)構(gòu)建攜帶Oct4、Sox2、K1f4、Nanog四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的嵌合

5、型腺病骨架質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定確定為正確克隆,并于HEK293細(xì)胞中包裝出病毒。4)利用攜帶4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的嵌合型腺病毒感染UCMSCs,出現(xiàn)類似hESCs的克隆團(tuán)細(xì)胞,還需進(jìn)一步證實(shí)iPSC的誘導(dǎo)情況。
　　 結(jié)論:1)成功于人臍帶中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞,并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)成hESCs樣克隆團(tuán)細(xì)胞,該細(xì)胞與hESCs相關(guān)的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均不同程度的上調(diào)表達(dá),表現(xiàn)出類似hESCs特征。2)成功構(gòu)建攜帶Oct4、Sox2、Klf4、Nan