體內(nèi)凝集反應(yīng)對(duì)凝血系統(tǒng)及組織病理影響的研究.pdf

1、目的：二十世紀(jì)至今，流感在世界范圍內(nèi)多次暴發(fā)流行，全球每年約有三百萬(wàn)到五百萬(wàn)的重癥流感病例，人感染流感病毒的死亡率可以達(dá)到60％以上，其高死亡率和新發(fā)流感病毒的不斷出現(xiàn)對(duì)人類健康造成了巨大的威脅。其中，流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)的變異是造成新發(fā)流感病毒流行的關(guān)鍵因素。據(jù)研究，重癥感染可以造成廣泛的組織病理?yè)p傷及嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至出現(xiàn)膿毒癥，導(dǎo)致微循環(huán)障礙和微血栓形成等，并引起繼發(fā)性的全身多器官功能障礙(multi

2、ple organ dysfunction syndrome,MODS)；過(guò)去很多研究認(rèn)為體內(nèi)較高的病毒載量及過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)是重癥患者免疫病理?yè)p傷的主要機(jī)制。但是至今為止，仍有許多發(fā)病機(jī)制和宿主免疫反應(yīng)等問(wèn)題尚未獲得明確闡述。因此需要全面、多方面進(jìn)行探討研究。血凝素作為病毒膜表面最為主要的糖蛋白，在病毒感染和發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，也一直是研究的熱點(diǎn)。血凝素不僅是流感病毒的重要組成成分，同時(shí)也存在于許多細(xì)菌、植物及其他致病微生物中，并且

3、均具有凝集紅細(xì)胞的特性。血凝素在體外引起紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象眾所周知，但對(duì)體內(nèi)凝集反應(yīng)還尚未見研究。當(dāng)血凝素在體內(nèi)達(dá)到一定濃度后，可引起凝集反應(yīng)，是否體內(nèi)凝集反應(yīng)在重癥患者繼發(fā)凝血功能失衡、病理?yè)p傷、微循環(huán)障礙及微血栓形成中起著不可忽略的作用目前尚無(wú)報(bào)道；因此，為了更好地驗(yàn)證體內(nèi)凝集反應(yīng)的作用，我們用血凝素誘導(dǎo)體內(nèi)凝集反應(yīng)，探究凝集反應(yīng)對(duì)凝血系統(tǒng)、組織病理?yè)p傷等的影響，以期為重癥的診療提供新思路。
　　方法：通過(guò)體外血凝試驗(yàn)測(cè)

4、得血凝素的凝集效價(jià)，根據(jù)大鼠血液總量及血液中紅細(xì)胞比例計(jì)算血凝素誘發(fā)大鼠體內(nèi)發(fā)生凝集反應(yīng)的起始濃度。根據(jù)該濃度將血凝素、滅活的血凝素稀釋成不同濃度(5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)，分別經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi)，劑量為1.5ml/100g體重,生理鹽水作為對(duì)照組。觀察大鼠的一般狀態(tài)、生物學(xué)表現(xiàn)；在顯微鏡下觀察凝集反應(yīng)(10min,30min,2h,4h,6h,12h,24h)，應(yīng)用比色法觀察溶血現(xiàn)象(30min)。應(yīng)用10mg

5、/ml濃度HA組別測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)(1h,2h,4h,6h,12h,24h)凝血指標(biāo)纖維蛋白原(fibrinogen, FIB)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)、凝血酶時(shí)間(thromboplastin time,TT)、活化的部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(International Normalized Ratio,INR

6、)的變化。根據(jù)凝血指標(biāo)的變化趨勢(shì)，于凝血變化最為明顯的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定各個(gè)實(shí)驗(yàn)組不同濃度中(5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)凝血指標(biāo)(FIB、PT、TT、APTT、INR)的變化，及應(yīng)用蘇木素-伊紅(Haematoxylin and eosin,HE)染色，觀察組織病理變化情況。
　　結(jié)果：各濃度的血凝素組(5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)均能在體內(nèi)誘發(fā)凝集反應(yīng)，并出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。另外，隨著血凝素濃度的增加，凝

7、集反應(yīng)及溶血現(xiàn)象逐漸明顯。同時(shí)，大鼠隨著注射血凝素濃度的增加，逐漸出現(xiàn)異常的生物學(xué)表現(xiàn)，包括活動(dòng)力下降、反應(yīng)性差、豎毛、弓背、四肢麻痹、呼吸急促、甚至死亡等現(xiàn)象。在凝血指標(biāo)方面，各濃度(5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)血凝素組，F(xiàn)IB測(cè)定值分別為(1.25±0.06)g/L、(0.83±0.16)g/L和(0.55±0.23)g/L均顯著低于生理鹽水對(duì)照組的(1.95±0.29)g/L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；濃

8、度為10mg/ml、20mg/ml的血凝素實(shí)驗(yàn)組，PT、TT、APTT、INR測(cè)定值分別為：(11.48±1.43)s、(63.85±8.13)s、(23.62±4.06)s、(0.95±0.10)和(14.83±1.00)s、(95.63±2.50)s、(44.50±4.63)s、(1.21±0.11)，均顯著高于對(duì)照組的(9.88±0.81)s、(47.97±4.82)s、(17.13±2.14)s和(0.80±0.06)，差異有統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。病理學(xué)檢查中，鏡下可見肺臟有明顯充血和水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間隔破壞等彌漫性肺損泡傷特點(diǎn)，且隨著血凝素濃度的增加，病理變化更加明顯。在20mg/ml的血凝素組，腎臟表現(xiàn)出腎小管的阻塞、水腫、淤血改變；肝臟組織中，肝細(xì)胞排列疏松、不規(guī)則，肝細(xì)胞變性等。
　　滅活后的各濃度血凝素組，體內(nèi)外均未引起紅細(xì)胞凝集反應(yīng)及溶血現(xiàn)象，各凝血指標(biāo)(FIB、PT、TT、APTT、INR)檢測(cè)值與生理鹽水對(duì)照組差異無(wú)顯著性(