黃粉蟲體內脂類抗菌活性物質及凝集素的研究.pdf

1、試驗分別用五種不同有機溶劑：丙酮、石油醚、無水乙醇、苯、乙酸乙酯對黃粉蟲幼蟲和成蟲勻漿物進行浸泡提取，選用大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subilis)、普通變形桿菌(Proteas valgaris)、黃曲霉(Aspergillus lfavas)、黑曲霉(Aspergillus nige)作為指示菌，采用圓形紙片擴散抑菌法檢

2、測上述各提取物對6種指示菌的抗菌活性，結果表明乙酸乙酯提取物的抗菌效果最好，對6種指示菌均表現了很強的抗菌作用，以后試驗選用乙酸乙酯作為黃粉蟲體內脂類抗菌活性物質的提取劑。 選用乙酸乙酯對黃粉蟲幼蟲和成蟲勻漿物進行浸泡提取，利用圓形紙片擴散抑菌法，分別檢測幼蟲和成蟲脂類粗提物對11種常見細菌的抗菌活性，結果表明：黃粉蟲幼蟲和成蟲提取物粗品對11種細菌均有顯著抑菌效果，但對同一種菌來說，兩種粗提物的抑制效果不同，而且同一提取物對不

3、同菌的敏感性也不同。 黃粉蟲幼蟲和成蟲粗提取物經硅膠(100-200目)柱層析后，分離出三種不同極性洗脫組份：無極性組份(石油醚洗脫組份)、弱極性組份(苯洗脫組份)、強極性組份(乙醇洗脫組份)?？咕钚詸z測結果顯示，幼蟲和成蟲的石油醚、苯洗脫組份對11種供試細菌均無抑菌作用；而兩種乙醇洗脫組份對11種供試菌都表現了很強的抑菌效果。 分別將黃粉蟲幼蟲和成蟲脂類粗提物、乙醇洗脫組份進行最低抑菌濃度MIC(Minimun in

4、hibitory concentration)試驗，結果表明：幼蟲和成蟲乙醇洗脫組份對各種菌的MIC值與粗提物相比，明顯降低。 利用以下兩種展層劑：幼蟲(石油醚：丙酮=3:2)、成蟲(石油醚:乙酸乙酯=3:1)對黃粉蟲幼蟲和成蟲乙醇洗脫組份進行薄層層析，分別得到四個條帶。將收集的各條帶用乙醇溶解，進行抗菌試驗，結果顯示幼蟲乙醇洗脫組份薄層層析得到的四個條帶中，Rf0.62的抗菌活性最強；成蟲乙醇洗脫組分薄層層析得到的四個條帶中R

5、t0.625的抗菌活性較之其它條帶較強。分別將這兩條活性較強的條帶樣品經氣相色譜-質譜法(GC-MS)分析其化學成分，結果顯示幼蟲和成蟲抗菌活性較強條帶的化學成分有所不同：幼蟲活性較強條帶的化學成分主要是肉豆蔻酸，成蟲活性較強條帶的化學成分主要是(E)-9-十八碳烯酸。 采用生長速率法檢測幼蟲和成蟲粗提物對黃曲霉、玉米大斑病病菌(Helminthosporiu)、稻瘟病病菌(Piricularia oryzae)、黑曲霉的抑菌活

6、性，結果顯示兩種粗提物對四種受試真菌都具有很強的抑制效果，這一發(fā)現將為開發(fā)新的抗真菌藥物提供重要來源。 黃粉蟲幼蟲和成蟲三種不同極性組分對4種受試真菌菌絲生長的影響結果顯示幼蟲和成蟲三種不同極性洗脫組份對四種菌都表現了一定的抑制作用，但抑制效果不同，乙醇洗脫組分對各種菌的抑制效果最好。 黃粉蟲幼蟲和成蟲脂類薄層層析各條帶對4種真菌的相對抑制率結果顯示，各條帶對4種真菌都具有一定的抑制效應，其中幼蟲的Rf0.475和成蟲的

7、Rf0.337對四種真菌菌絲生長速率的抑制效應明顯強于其它條帶，抑制率都在30％以上。 分別將這兩條抗真菌活性較強的條帶樣品經氣相色譜-質譜(GC-MS)法進行化學成分分析，結果顯示當保留時間為3.740min，幼蟲條帶Rf0.475樣品有一個較大的峰，它代表相對含量較高的甘油(76.56％)；當保留時間為23.756 min時，成蟲條帶Rf0.337樣品有一個較大的峰，它代表相對含量較高的甘油單油酸酯(80％)。幼蟲和成蟲體內

8、抗真菌物質主要成分和含量的不同，可能正是造成抗真菌活性差異的主要原因。 黃粉蟲幼蟲、蛹、成蟲三種蟲態(tài)的凝集素對11種紅細胞的凝集效價結果顯示，幼蟲、蛹、成蟲三種蟲態(tài)的凝集素對不同紅細胞的凝集效應不同，蛹凝集素的凝集效應最弱，成蟲凝集素的凝集效應最強。三種蟲態(tài)的凝集素對兔血紅細胞都表現了較高的凝集效應，以后試驗中均以2％家兔紅細胞作為指示細胞。 分別對黃粉蟲幼蟲、蛹、成蟲三個蟲態(tài)的凝集素的理化性質進行測定：pH敏感性試驗結

9、果顯示，三種蟲態(tài)的凝集素都具有很強的耐酸性；熱敏感性試驗結果顯示，三種蟲態(tài)的凝集素都對熱較敏感，80℃以上時三種蟲態(tài)的凝集素均失去凝集活性；5種不同濃度的金屬離子對黃粉蟲三種蟲態(tài)的凝集素凝集效應的影響結果顯示，Zn2+、Cu2+能明顯提高三種凝集素的凝集活力，尤其是Cu2+的激活作用更強；L-鼠李糖與果糖溶液對3種蟲態(tài)的凝集素的凝集活性表現了較強的抑制作用。 采用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose(Fast Flow)離子

10、交換層析、SephacrylS-200-HR凝膠過濾層析對黃粉蟲幼蟲凝集素進行純化，SDS-PAGE顯示為明顯的單一條帶，亞基分子量約為76KDa；采用Sephacryl S-200-HR凝膠過濾層析法測得其表觀分子量為238KDa，說明黃粉蟲凝集素為多聚體，是由76KDa的亞基聚合成分子量為278KDa的蛋白。 用紫外分光光度法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白為對照，測得黃粉蟲凝集素樣品中蛋白濃度為2.4 ug/ul。蒽酮-硫酸

11、法檢測黃粉蟲幼蟲凝集素樣品中中性糖含量為53.25ug/ml。 采用日立835氨基酸自動分析儀測定氨基酸組分，除色氨酸水解被破壞未測出外，黃粉蟲幼蟲凝集素可測出17種氨基酸，其中含量最高的為谷氨酸，其次為天門冬氨酸和亮氨酸，分別占氨基酸總數的11.87％和9.256％，含量最少的為甲硫(蛋)氨酸和組氨酸，分別占氨基酸總數的1.61％和1.81％。 用UV2201型紫外分光光度計對黃粉蟲幼蟲凝集素溶液進行240-320nm

12、的波長掃描，以蒸餾水為空白對照，取樣間隔為1nm，測得黃粉蟲幼蟲凝集素紫外吸收光譜的最大吸收峰在265nm。 本研究以黃粉蟲為材料，使用有機溶劑提取體內的脂類物質，進行體外抗菌活性試驗，研究抗菌物質對常見的細菌和動植物病原菌的抑制作用，并利用氣相色譜-質譜(GC-MS)法進行化學成分分析，以此來了解其抗菌作用機理，為尋找抗生素替代品尋找新的材料來源。其次通過對黃粉蟲幼蟲、蛹、成蟲三種蟲態(tài)的凝集素凝集紅細胞的特性及理化性質的研究，