河蜆體內(nèi)脂類抗菌物質(zhì)及凝集素的研究.pdf

1、河蜆是一種習(xí)見(jiàn)的分布范圍很廣的淡水貝類，作為一種傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類，成本低、產(chǎn)量高、易捕撈，抗藥性強(qiáng)，具有很大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和潛力，要合理有效地利用這一水產(chǎn)資源。本實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)代生物技術(shù)，從河蜆體內(nèi)提取具有抗菌活性的脂類物質(zhì)，以期為尋找新的藥物來(lái)源和新的抗菌物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還從河蜆體內(nèi)提取了凝集素，從而為尋找新的凝集素來(lái)源和防治貝類病害提供理論基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)用7種常見(jiàn)的不同極性的有機(jī)溶劑：甲醇:甲苯(V:V=3:1)混

2、合液、石油醚、乙醇、乙酸乙酯、丁酮、苯、異戊醇對(duì)河蜆軟體部分勻漿物進(jìn)行提取，得到脂類粗提物，配置成同等濃度，并用12種細(xì)菌和6種真菌檢測(cè)不同溶劑提取物的抗菌活性。結(jié)果表明，不同溶劑提取物對(duì)不同受試菌的抗菌效果存在差異，其中乙酸乙酯提取物對(duì)受試菌的抗菌效果較強(qiáng)，抑菌圈也最明顯，乙酸乙酯是提取河蜆體內(nèi)脂類抗菌物質(zhì)比較理想的極性有機(jī)溶劑。 用乙酸乙酯對(duì)河蜆軟體部分進(jìn)行浸泡，得到脂類粗提物，通過(guò)MIC實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明河蜆乙酸乙酯提取物對(duì)大

3、腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococus aereus)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subilis)具有較好的抑菌活性，最低抑菌濃度達(dá)0.00625 g/mL，對(duì)大部分細(xì)菌的MIC集中在0.025 g/mL-0.0125 g/mL范圍內(nèi)。在真菌的MIC實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)青霉(Penicillium chrysogenum)和黑曲霉(Aspergillus niger)的最小抑菌濃度均為0.1

4、 g/mL，之后更小濃度的提取物對(duì)兩種真菌未見(jiàn)有抑菌現(xiàn)象。 利用硅膠柱層析法對(duì)河蜆乙酸乙酯粗提物進(jìn)行分離，依次分別以非極性溶劑石油醚、弱極性溶劑苯和強(qiáng)極性溶劑無(wú)水乙醇進(jìn)行洗脫，得到5種不同的洗脫組分，即石油醚洗脫組分、苯洗脫組分、乙醇洗脫組分以及兩種過(guò)渡溶劑石油醚-苯和苯-乙醇洗脫組分，之后進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。結(jié)果表明，不同極性的溶劑，其洗脫得到的不同組分的抗菌活性也不同，乙醇洗脫組分的抗菌活性最強(qiáng)，對(duì)受試的12種細(xì)菌和6種真菌均

5、具有抗菌活性，對(duì)細(xì)菌的最大抑菌圈達(dá)42.0±0.3 mm，對(duì)黑曲霉和青霉這2種真菌的抑菌圈分別達(dá)到12.5±0.1 mm和15.5±0.3 mm。 將乙醇洗脫組分對(duì)細(xì)菌進(jìn)行MIC實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，乙醇洗脫組分對(duì)各種細(xì)菌的最低抑菌濃度不同，對(duì)大部分細(xì)菌的MIC都集中在0.0125 g/mL-0.00625 g/mL范圍內(nèi)，其中對(duì)短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)最敏感，其最低抑菌濃度達(dá)0.003125g/mL。

6、 用展層劑三氯甲烷:甲醇(V:V=19:1)，對(duì)乙醇洗脫組分進(jìn)行薄層層析(TLC)，分離出5條帶，用12種細(xì)菌檢測(cè)各條帶的抗菌活性。結(jié)果顯示條帶Rn對(duì)受試細(xì)菌沒(méi)有抑制作用，其它條帶對(duì)不同受試細(xì)菌均有不同程度的抑制作用。其中，條帶Rf4的抑菌作用最顯著，對(duì)藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)的抑菌圈直徑達(dá)到了16.5 mm。 將抗菌活性最強(qiáng)的條帶Rf4(0.952)經(jīng)氣相色譜.質(zhì)譜分析其成分，結(jié)果表明條帶Rf4(0.952)

7、中大多都是烷烴類物質(zhì)，其中含量較多的有二十七烷(15.26％)、二十烷(13.27％)、2-甲基-二十烷(12.21％)、二十九烷(10.41％)、三十烷(7.86％)等，除了這些烷烴類物質(zhì)，含量較多的還有苯甲酸(14.43％)，此外還有少量的環(huán)丙硅壬酸(5.42％)和1-甲基-2-苯基吲哚(2.10％)。 用PBS緩沖液對(duì)河蜆軟體部分進(jìn)行浸泡提取，得凝集素粗品，以13種動(dòng)物及人的紅細(xì)胞檢測(cè)河蜆凝集素粗提液的凝集活力。結(jié)果表明家

8、兔紅細(xì)胞最敏感。 將河蜆凝集素粗提液經(jīng)(30％-40％)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Sephacryl S-200-HR分子篩層析，得到河蜆凝集素(CFL)。分子量方面，CFL分子是由單個(gè)的約46 KDa亞基構(gòu)成的糖蛋白，其中，中性糖含量約為6.547％。 氨基酸組分測(cè)定，除色氨酸(Try)未測(cè)出外，CFL可測(cè)出17種氨基酸，其中谷氨酸(Glu)含量最高，約1.12 μg/mL，天門冬氨酸(

9、Asp)含量次之，約1.11 μg/mL，而含量最低為甲硫(蛋)氨酸(Met)，僅約0.20 μg/mL。 糖抑制方面，CFL對(duì)家兔紅細(xì)胞的凝集作用可被9種糖溶液不同程度的抑制。其中麥牙糖的抑制作用最明顯，使CFL對(duì)家兔紅細(xì)胞的凝集效價(jià)僅為22；蔗糖、D-乳糖和D-甘露糖的抑制作用次之，使凝集素的凝集效價(jià)降為23：其余6種糖溶液對(duì)凝集素的凝集活性的抑制作用相對(duì)較弱，使凝集素的凝集效價(jià)降為24。通過(guò)糖抑制實(shí)驗(yàn)可以知道某種凝集素能與

10、哪些糖類專一性結(jié)合，其實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還可以作為凝集素的分類依據(jù)，也為這些貝類凝集素的分離和純化時(shí)親和層析柱的選擇提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)有助于進(jìn)一步弄清貝類凝集素的具體作用機(jī)制。 環(huán)境影響因子方面，CFL在pH=7.0時(shí)，凝集活性最強(qiáng)；在不同溫度下處理15min，在25℃-50℃時(shí)，CFL的凝集活性基本保持不變，當(dāng)溫度≥60℃時(shí)，凝集活性逐漸降低，當(dāng)溫度達(dá)到90℃時(shí)，失去凝集活性；CFL的凝集活性在一定程度上依賴于某些金屬離子，實(shí)驗(yàn)所用4

11、種金屬離子中，Ca2+能明顯提高CFL對(duì)家兔紅細(xì)胞的凝集活性，影響最大；CFL對(duì)家兔紅細(xì)胞的凝集活性受到EDTA的抑制作用，且隨著EDTA濃度的增加，抑制作用也增強(qiáng)。 凝集素不僅能凝集不同種屬的動(dòng)物紅細(xì)胞，也能凝集其它種類的細(xì)胞。在受試的9種藻類細(xì)胞中，紫球藻(Porphyridium purpureum)對(duì)CFL最敏感，柵藻(Scenedesmus obliqnus)、心形扁藻(Platymonas cordiformis)以

12、及塔胞藻(Pyramimonas sp.)次之，CFL對(duì)它們均有凝集作用；在受試的12種細(xì)菌細(xì)胞中，藤黃八疊球菌、短小芽孢桿菌以及蠟狀芽苞桿菌(Bacillus cereus)對(duì)凝集素反映的敏感性強(qiáng)于其他細(xì)菌，河蜆凝集素對(duì)它們有明顯的凝集作用，河蜆凝集素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌幾乎沒(méi)有凝集作用，但對(duì)其它幾種受試細(xì)菌還存在不同程度的凝集作用。 對(duì)真菌孢子萌發(fā)的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CFL對(duì)6種受試真菌的孢子萌發(fā)的影響

13、存在差異，在CFL濃度為2.5 mg/mL時(shí)，CFL能夠抑制黃曲霉(Aspergillus flavas)、稻瘟病病菌(Piricularia oryzae)、玉米大斑病菌(Helminthos porium)、根霉(Rhizopusstolonoifer)、青霉及黑曲霉6種真菌的孢子萌發(fā)。其中，CFL對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制作用較強(qiáng)，抑制率達(dá)到了70.83％；對(duì)稻瘟病病菌孢子和根霉孢子萌發(fā)的抑制作用次之，抑制率分別為44.28％和42.