鼻咽癌細(xì)胞中14-3-3σ相關(guān)miRNAs差異表達(dá)譜研究.pdf

1、[目的]通過(guò)miRNA芯片技術(shù)獲得14-3-3σ（SFN）所調(diào)控的miRNAs差異表達(dá)譜；通過(guò)RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性；生物信息學(xué)分析獲得的miRNAs差異表達(dá)譜所涉及的信號(hào)通路；闡明 miRNA-SFN之間的調(diào)控機(jī)制在鼻咽癌中的作用。
　　[方法]構(gòu)建14-3-3σ高表達(dá)的重組細(xì)胞系5-8F-14-3-3σ(+)以及對(duì)照組細(xì)胞系5-8F-14-3-3σ(-)。經(jīng)過(guò)Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中14-3-3σ蛋

2、白表達(dá)水平，確定轉(zhuǎn)染成功。收集細(xì)胞，提取RNA，檢測(cè)總RNA純度，通過(guò)miRNA芯片檢測(cè)SFN所調(diào)控的miRNAs差異表達(dá)譜。miRanda軟件分析了下調(diào)倍數(shù)最大的10個(gè)靶 miRNAs的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性分值（mirSVR）和序列保守性分值（PhastCons），確定SFN的靶miRNAs。通過(guò)miRwalk在線軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析SFN的靶miRNAs。結(jié)合基因芯片結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，找出SFN的靶miRNA。TargetScan在線軟件預(yù)

3、測(cè)靶miRNA和SFN的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)SFN的靶miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，與芯片結(jié)果進(jìn)行比較。生物信息學(xué)分析14-3-3σ相關(guān) miRNAs表達(dá)譜涉及到的信號(hào)通路、生物學(xué)過(guò)程、分子功能及細(xì)胞組分，從中找出關(guān)鍵的信號(hào)通路。
　　[結(jié)果]1.Western blot檢測(cè)5-8F-14-3-3σ(+)細(xì)胞中14-3-3σ蛋白的表達(dá)水平明顯高于5-8F-14-3-3σ(-)和5-8F細(xì)胞，而5-8F-14-3-3σ(-)和5-8F兩

4、組間蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。2. miRNA芯片檢測(cè)5-8F-14-3-3σ(+)和5-8F-14-3-3σ(-)兩個(gè)細(xì)胞系之間的差異miRNAs，獲得14-3-3σ調(diào)控的miRNAs差異表達(dá)譜。miRNA芯片顯示SFN高表達(dá)后有239個(gè)miRNAs差異表達(dá)，其中上調(diào)的miRNAs有58個(gè)，而下調(diào)的miRNAs有181個(gè)。3.10個(gè)下調(diào)差異倍數(shù)最大的miRNAs中，通過(guò)miRanda軟件分析發(fā)現(xiàn)符合條件的miRNAs（mirSVR≤-0.1

5、，PhastCons0.4~0.7）有2個(gè)。因此，miR-675，miR-4253可能是SFN的靶miRNA。4. SFN的靶miRNAs通過(guò)miRwalk在線軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：10個(gè)軟件當(dāng)中有6個(gè)軟件同時(shí)預(yù)測(cè)到了miR-145和miR-220c可與SFN結(jié)合；有5個(gè)軟件同時(shí)預(yù)測(cè)到了miR-597，miR-129-3p，miR-603，miR-769-3p，miR-431，miR-608，miR-766，miR-31，miR

6、-532-3p，miR-675，miR-922，miR-329，miR-483-3p，miR-554，miR-642，miR-886-5p，miR-362-3p，miR-486-3p等18個(gè)miRNAs可與SFN結(jié)合。與基因芯片結(jié)果對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)，miR-675可能是SFN作用的靶miRNA。5. Targetscan軟件預(yù)測(cè)miR-675與SFN結(jié)合的位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該結(jié)合位點(diǎn)位于SFN基因226-232堿基，其結(jié)合的序列是5'-CCGCA

7、CC-3'與miR-675部分序列一致。miRNA通過(guò)結(jié)合到SFN基因的3`-UTR,調(diào)控SFN的表達(dá)，兩者的結(jié)合具有特異性，進(jìn)一步說(shuō)明SFN可能是miR-675的可靠的作用靶基因。6.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，差異miRNAs調(diào)控的靶基因當(dāng)中，涉及到的信號(hào)通路主要包括WNT、MAPK、TGF-β。7.RT-PCR驗(yàn)證 miR-675和miR-4253的表達(dá)水平，miR-675和miR-4253在5-8F-14-3-3σ(+)中表達(dá)量分別為對(duì)

8、照組5-8F-14-3-3σ(-)的-3.458和-5.098倍，與基因芯片結(jié)果一致。表明基因芯片結(jié)果檢測(cè)可靠。
　　[結(jié)論]1.獲得了14-3-3σ調(diào)控的miRNAs表達(dá)譜，在鼻咽癌細(xì)胞中14-3-3σ表達(dá)增高后，上調(diào)的miRNAs有58個(gè)，下調(diào)的miRNAs有181個(gè)；2.生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，14-3-3σ相關(guān)miRNAs表達(dá)譜涉及到的功能復(fù)雜，其中WNT、MAPK、TGF-β信號(hào)通路可能與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)；3. miR