p73α與14-3-3σ在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其相互作用的研究.pdf

1、目的：腫瘤抑制基因p53在1979年被首次報(bào)道，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。野生型p53蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制惡性腫瘤發(fā)展中起著重要的作用。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)基因p63和p73，它們與p53基因在結(jié)構(gòu)上高度同源，功能上也存在著非常復(fù)雜的關(guān)系，這一類基因稱為p53基因家族，但其功能尚不完全明了。14-3-3σ是14-3-3基因家族中唯一一個(gè)能夠被DNA損傷所誘導(dǎo)的成員。作為細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，14-3-3σ的活化可以使

2、細(xì)胞周期停滯于G2期，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究采用多種不同的實(shí)驗(yàn)方法，研究了不同p53狀態(tài)的乳腺癌細(xì)胞系中p73α與14-3-3σ的基因表達(dá)情況，及p73α與14-3-3σ在基因水平上的相互調(diào)節(jié)作用。目的在于探索p73α與14-3-3σ在細(xì)胞增殖及癌變中的作用，及p73α與14-3-3σ之間的相互關(guān)系。 方法：本研究選用p53野生型人類乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，p53突變型人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453，MDA-MB-231，

3、MDA-MB-436，p53缺失型人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-157，以及模式細(xì)胞SV40轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞系COS-7，p53缺失型人類肺癌細(xì)胞系H1299，通過(guò)MTT分析，RT-PCR，Westernblot和免疫沉淀的方法研究在MDA-MB-436細(xì)胞系中，突變的p53對(duì)阿霉素(adrimycin，ADR)誘導(dǎo)DNA損傷產(chǎn)生的應(yīng)答反應(yīng)；通過(guò)基因轉(zhuǎn)染，研究MDA-MB-436細(xì)胞系中，p73α對(duì)p53有否替代作用，能否誘導(dǎo)p53

4、的下游基因14-3-3σ的表達(dá)；然后又運(yùn)用基因克隆，熒光素酶報(bào)告劑分析以及克隆形成實(shí)驗(yàn)的方法研究p73α和14-3-3σ之間的相互作用及關(guān)系。 結(jié)果：1MTT分析結(jié)果：五種乳腺癌細(xì)胞系，在ADR(1μM)分別處理24小時(shí)和48小時(shí)后，p53野生型的MCF-7的細(xì)胞生存率分別為50.20％和16.58％；p53突變型的MDA-MB-453的細(xì)胞生存率分別為58.87％和9.61％；p53突變型的MDA-MB-231的細(xì)胞生存率分別

5、為77.09％和34.25％；p53缺失型的MDA-MB-157的細(xì)胞生存率分別為85.50％和12.48％；而p53突變型的MDA-MB-436的細(xì)胞生存率分別為99.20％和98.62％。 2ADR處理前后14-3-3σ的表達(dá)狀況：ADR(1μM)處理24小時(shí)以后，14-3-3σ的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平在MCF-7，MDA-MB-453和MDA-MB-231細(xì)胞系中均升高；而在MDA-MB-436細(xì)胞系中為降低；在MDA

6、-MB-157細(xì)胞系中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)14-3-3σ的表達(dá)。 3p73α在MDA-MB-436細(xì)胞系中的表達(dá)：在MDA-MB-436細(xì)胞系中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)p53蛋白的表達(dá)，而p73α的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平在ADR(1μM)處理24小時(shí)以后均輕度上調(diào)。 4轉(zhuǎn)染p73α對(duì)14-3-3σ表達(dá)的影響：在MDA-MB-436細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染進(jìn)外源性的p73α之后，14-3-3σ的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)大幅度升高。 6轉(zhuǎn)染14-

7、3-3σ對(duì)p73α的影響：熒光素酶報(bào)告劑分析顯示，在H1299細(xì)胞系中，跟內(nèi)參照相比，單獨(dú)轉(zhuǎn)染25ng的p73α可以使Bax和p21WAF1的轉(zhuǎn)錄活性分別增加5.688倍和9.061倍；共轉(zhuǎn)染恒定量(25ng)的p73α和逐漸增加量(100ng，200ng，400ng)的14-3-3σ之后，Bax的轉(zhuǎn)錄活性和內(nèi)參照相比分別高出7.734，12.143，27.085倍，p21WAF1的轉(zhuǎn)錄活性和內(nèi)參照相比分別高出12.678，15.829

8、，15.191倍；單獨(dú)轉(zhuǎn)染400ng的14-3-3σ之后，Bax和p21WAF1的轉(zhuǎn)錄活性和內(nèi)參照相比基本沒(méi)有變化。RT-PCR結(jié)果也顯示，在H1299細(xì)胞系中，共轉(zhuǎn)染p73α和14-3-3σ之后，p21WAF1和Bax的轉(zhuǎn)錄活性比單獨(dú)轉(zhuǎn)染p73α?xí)r的轉(zhuǎn)錄活性高。在H1299細(xì)胞系中，共轉(zhuǎn)染p73α和14-3-3σ之后，p73α的表達(dá)水平比單獨(dú)轉(zhuǎn)染p73α?xí)r高。在MDA-MB-436細(xì)胞系中，共轉(zhuǎn)染p73α和14-3-3σ之后，細(xì)胞的死

9、亡程度比單獨(dú)轉(zhuǎn)染p73α后的死亡程度高。 結(jié)論：1五種乳腺癌細(xì)胞系的MTT分析結(jié)果顯示，p53野生型的MCF-7，p53突變型的MDA-MB-453，MDA-MB-231，p53缺失型的MDA-MB-157對(duì)ADR誘導(dǎo)的DNA損傷敏感或中度敏感，而p53突變型的MDA-MB-436細(xì)胞系對(duì)ADR誘導(dǎo)的DNA損傷不產(chǎn)生應(yīng)答；同時(shí)p53蛋白在MDA-MB-436細(xì)胞系中不表達(dá)；ADR處理后，14-3-3σ在MDA-MB-436細(xì)胞系

10、中的表達(dá)水平下降。提示，在MDA-MB-436細(xì)胞系中，突變后的p53不能對(duì)ADR誘導(dǎo)的DNA損傷產(chǎn)生應(yīng)答，從而不能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。 2在MDA-MB-436細(xì)胞系中，ADR處理后p73α的表達(dá)水平輕度上調(diào)。而在轉(zhuǎn)染外源性的p73α之后，14-3-3σ的表達(dá)水平大幅度升高。提示：p73α可以代替p53，在p53突變的MDA-MB-436細(xì)胞系中誘導(dǎo)14-3-3σ的表達(dá)。 3在H1299細(xì)胞系中，共轉(zhuǎn)染p73α