基于基因和分子靶向治療技術的C225-p5HRe-cfosP-iNOs-IFNG磁性白蛋白納米球治療肺癌的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述：
　　第一章 腫瘤治療基因合成和表達研究:基于乏氧/輻射雙調(diào)控基因電路技術的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表達質粒的構建與鑒定及其在細胞內(nèi)的誘導表達
　　目的:構建pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(即p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG)真核表達質粒，并對其進行鑒定。評價其在GLC-82細胞中的誘導表達情況。
　　方法:①以pUC57-Sim

2、ple-cfosp為模板，將cfosp片段酶切下來連接至pYr-adshuttle-8載體得到pYr-ads-8-cfosp真核表達質粒。②以pDONR223-IFNG為模板，PCR擴增IFNG片段（IFNG即IFN-γ的基因片段），然后將其亞克隆至pYr-adshuttle-8載體，構建pYr-ads-8-IFNG真核表達質粒。③將pUC57-Simple-cfosp及目的載體pYr-ads-8-IFNG雙酶切，然后進行連接，構建pY

3、r-ads-8-cfosp-IFNG真核表達質粒。
　　結果:①酶切、測序鑒定結果表明每步均得到了目的質粒，測序發(fā)現(xiàn)插入片段序列無改變，并且開放讀碼框正確。②用QT-PCR檢測IFN-γ和iNOS基因的相對表達量，結果表明p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG與其他質粒相比，表達量最高，與沒有乏氧序列的組(⑥pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG)相比，IFN-γ的表達量高了約1.46倍，iNOS的表達量高了2.11倍

4、(p＜0.05)。與沒有基因電路的組（⑤pYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG）相比，IFN-γ的表達量高了約1.32倍(p＜0.05)。
　　結論:①成功構建了基于乏氧/輻射雙調(diào)控基因電路技術的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表達質粒及中間各用于比較的質粒。并且酶切鑒定、測序鑒定均證實構建成功。
　?、谟肣T-PCR檢測了C-fos啟動子的時效性，C-fos啟動子在2Gy的X射線誘導24小時后，靶

5、基因的表達量最高。評價了p5HRE-cfosp-iNO S-IFNG在肺癌細胞內(nèi)的誘導表達，驗證了HRE在缺氧環(huán)境中對輻射啟動子的增強作用，和基因電路技術的有效性。
　　第二章 C225-Fe3O4/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG（靶向載基因磁性白蛋白納米球）的制備及靶向性研究
　　目的:①制備表征Fe3O4磁性納米粒，用PEI修飾Fe3O4磁性納米粒并進行表征，研究PEI-Fe3O4復合物作為基因載體的可行性。

6、②制備載基因磁性白蛋白納米球及靶向載基因磁性白蛋白納米球。③鑒定靶向載基因磁性白蛋白納米球的免疫特性（即靶向性）并觀察其轉染效率。④從體內(nèi)外水平，探討靶向載基因磁性白蛋白納米球對人肺癌細胞GLC-82細胞的靶向效應。
　　方法:①采用化學共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒，聚乙烯亞胺(PEI)對其進行表面修飾。②采用透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)，ZETASIZER3000激光粒

7、度分析儀，傅立葉紅外光譜(fourier transform infraredspectroscopy，F(xiàn)TIR)對修飾前后納米粒進行表征。③瓊脂糖凝膠電泳檢測PEI-Fe3O4結合DNA的情況。利用pEGFP-C1觀察PEI-Fe3O4介導外源基因轉染的效率。④采用去溶劑化-交聯(lián)法制備載基因磁性白蛋白納米球，用異型雙功能交聯(lián)劑SPDP耦連納米球和西妥昔單抗(C225)，制備成靶向載基因磁性白蛋白納米球，運用TEM、ZETA SIZER

8、3000激光粒度分析儀對其表征，在不同時間點測其在PBS緩沖液和RPMI1640培養(yǎng)液中的粒徑，評價其穩(wěn)定性。動態(tài)測定其體外釋放基因速率。用硫氰酸鹽分光光度法測其含F(xiàn)e量。
　　結果:①制備的Fe3O4和PEI-Fe3O4磁性納米粒表征:TEM檢測顯示磁性納米粒電子密度高、大小較一致，并且修飾前后形態(tài)大小差別不大;FTIR結果顯示了修飾后納米粒的特征峰值，證明了PEI的成功吸附;激光粒度分析儀電位分析顯示在pH為7的中性環(huán)境，F(xiàn)e

9、3O4納米粒的zeta電位值為0±0.5mV，而PEI修飾后納米粒子的電位值為36.3±0.6mV。②瓊脂糖凝膠電泳檢測到PEI-Fe3O4與DNA結合情況良好;PEI-Fe3O4可將外源基因轉染至GLC-82細胞并高效表達。③自制的空載白蛋白納米球及靶向載基因磁性白蛋白納米球在TEM檢測下為球形，大小均勻，并且在靶向載基因磁性白蛋白納米球中明顯地觀察到在電子密度較低的白蛋白納米球中包裹著電子密度較高的磁性納米粒。ZETA SIZER3

10、000激光粒度分析儀顯示載基因磁性白蛋白納米球的水合粒徑為189.5±2.4nm;靶向載基因磁性納米球的水和粒徑約為211.9±3.1nm。在pH為7的中性環(huán)境中，載基因磁性自蛋白納米球的zeta電位值是-37.9±0.4 mV，而耦聯(lián)了C225的靶向載基因磁性白蛋白納米球的電位值為-40.2±0.7 mV。在不同時間點測其在PBS緩沖液和RPMI1640培養(yǎng)液中的納米球粒徑差別不大，穩(wěn)定性良好。
　　結論:①應用化學共沉淀法已成

11、功制備了Fe3O4磁性納米粒且PEI成功地修飾于Fe3O4磁性納米粒。②修飾后的PEI-Fe3O4磁性納米?？梢宰鳛榛虻妮d體。③成功制備了白蛋白納米球、載基因磁性白蛋白納米球，成功耦連了西妥昔單抗與載基因磁性白蛋白納米球。④靶向載基因磁性白蛋白納米球具有緩釋作用，并且能高效轉染人肺癌細胞GLC-82。⑤細胞實驗和體內(nèi)磁共振實驗都說明靶向載基因磁性白蛋白納米球對人肺癌細胞GLC-82具有良好的靶向效應。
　　第三章 基于基因和分子

12、靶向治療技術的靶向載基因磁性白蛋白納米球治療肺癌的體內(nèi)外實驗研究
　　目的:①體外水平探討靶向載基因磁性白蛋白納米球治療人肺癌的作用。②通過動物實驗，從體內(nèi)水平探討靶向載基因磁性白蛋白納米球對肺癌的治療作用。
　　方法:①體外采用CCK8及流式細胞技術測定靶向載基因磁性白蛋白納米球體外治療肺癌的效果。并用透射電鏡觀察細胞超微結構的變化。②建立裸鼠肺癌移植瘤模型，將靶向載基因磁性白蛋白納米球經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠，經(jīng)輻射3次，6周

13、后處死裸鼠。計算腫瘤體積抑制率和質量抑制率，制作腫瘤組織標本，進行常規(guī)病理學檢查。③通過血清生化檢查和血常規(guī)檢測及各內(nèi)臟器官組織病理學觀察初步評價靶向輻射基因聯(lián)合治療的安全性。
　　結果:①CCK8實驗結果顯示靶向載基因磁性白蛋白納米球能明顯抑制人肺癌細胞GLC-82的增殖，F(xiàn)CM檢測顯示其能誘導GLC-82細胞的凋亡，且其效果較其他組顯著。透射電鏡下可觀察到各組細胞均有不同程度的凋亡，細胞內(nèi)可見磁性材料沉積。②靶向輻射基因聯(lián)合治

14、療組的腫瘤質量抑制率和腫瘤體積抑制率分別為82.54％和85.72％,明顯高于單抗治療組(36.51％、34.33％)、輻射放療組(42.06％、40.89％)、輻射基因聯(lián)合治療組(64.29％、65.64％)和靶向輻射聯(lián)合治療組(70.63％、72.57％)(p＜0.05)。③各治療組腫瘤有不同程度壞死，部分壞死灶可見炎性細胞浸潤。其中靶向輻射基因聯(lián)合治療組壞死程度最嚴重?？梢姶笃瑝乃涝睿瑝乃绤^(qū)域呈紅染，腫瘤細胞崩解，胞核消失，部分細

15、胞核固縮。其它治療組也均有不同程度的壞死，程度較靶向輻射基因聯(lián)合治療組輕，但也可見腫瘤細胞的密度下降，細胞排列松散，胞漿呈紅染。陰性對照組與各治療組的心肝脾肺腎等內(nèi)臟組織均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的病理學變化。
　　結論:①靶向輻射基因聯(lián)合治療能顯著抑制培養(yǎng)人肺癌細胞GLC-82的增殖，誘導細胞凋亡。②分子靶向治療、放療和基因治療三者聯(lián)合治療肺癌具有明顯的協(xié)同作用，能有效抑制肺癌的生長，效果優(yōu)于單一治療也優(yōu)于兩兩聯(lián)合治療。
　　第四章

16、靶向載基因磁性白蛋白納米球治療肺癌的分子機制研究
　　目的:從分子水平探討靶向載基因磁性白蛋白納米球介導的分子靶向聯(lián)合基因治療肺癌的機制。
　　方法:①采用免疫組織化學方法檢測治療后各組腫瘤組織中Bcl-2、Bax、survivin、VEGF、EGFR、PCNA、p53、Ki67蛋白的表達。②采用western blot檢測各治療組中Bcl-2、Ki67、survivin、caspase-3與caspase-8的表達量，使用

17、Gel-Pro32軟件對結果進行灰度分析。從分子水平上探討靶向載基因磁性白蛋白納米球介導的分子靶向聯(lián)合基因治療肺癌的分子機制。
　　結果:①單抗治療組、輻射放療組、輻射基因聯(lián)合治療組、靶向輻射聯(lián)合治療組、靶向輻射基因聯(lián)合治療組的Bax蛋白均有升高，但靶向輻射基因聯(lián)合治療組上升最明顯。而單抗治療組、輻射放療組、輻射基因聯(lián)合治療組、靶向輻射聯(lián)合治療組、靶向輻射基因聯(lián)合治療組的Bcl-2、Ki67、p53、PCNA和survivin蛋白

18、均有下降，其中靶向輻射基因聯(lián)合治療組下降得最明顯。②Wesrem blot的結果顯示，各治療組與陰性對照組相比Bcl-2、Ki67、survivin均有下調(diào)，而caspase-3與caspase-8的表達上調(diào)。其中以靶向輻射基因聯(lián)合治療組最為顯著。
　　結論:靶向載基因磁性白蛋白納米球介導的分子靶向聯(lián)合基因治療肺癌的機制可能與下調(diào)PCNA、Ki67蛋白表達而抑制腫瘤增殖;抑制Bcl-2、p53、survivin蛋白表達，上調(diào)Bax