IL-6在人骨肉瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞自我種植中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，隨著近些年手術(shù)和輔助化療技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，骨肉瘤的治愈率得到大幅提高。但是對于發(fā)生轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)的骨肉瘤患者，其治療效果卻一直欠佳，因此解決骨肉瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的難題成為改進(jìn)治療、改善預(yù)后的關(guān)鍵之一。研究表明腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與一種新的轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)，即腫瘤的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs)自我種植現(xiàn)象。這種現(xiàn)象是指CTCs除了能夠定植遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移灶外，轉(zhuǎn)移灶或者原發(fā)灶來源的CTCs還能夠回

2、到原發(fā)灶，再次發(fā)生種植，其能夠促進(jìn)原發(fā)灶腫瘤的進(jìn)展，也同時(shí)成為了術(shù)后原發(fā)部位復(fù)發(fā)的根源之一。我們已經(jīng)在前期研究中證實(shí)了人骨肉瘤荷瘤裸鼠模型中存在CTCs自我種植的現(xiàn)象，并對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探索，發(fā)現(xiàn)IL-6可能在原位腫瘤吸引CTCs種植方面發(fā)揮重要作用。
　　目的：
　　在前期研究的基礎(chǔ)上，對人骨肉瘤中CTCs的自我種植現(xiàn)象涉及的具體機(jī)制進(jìn)行更深一步的研究。
　　1.進(jìn)一步在體外水平落實(shí)驗(yàn)證IL-6在原位腫瘤吸引C

3、TCs過程中發(fā)揮了促進(jìn)作用;
　　2.揭示IL-6在骨肉瘤增殖、迀移、侵襲、生長和轉(zhuǎn)移等方面起到的具體作用；
　　3.探索IL-6發(fā)揮促CTCs遷移作用涉及的具體信號通路，并針對該信號通路中的關(guān)鍵蛋白選擇抑制藥物；
　　4.通過下調(diào)原位腫瘤中IL-6的表達(dá)，或者藥物抑制IL-6發(fā)揮作用的具體信號通路，進(jìn)一步在體內(nèi)水平上證實(shí)IL-6在CTCs自我種植過程中發(fā)揮的重要作用。
　　方法：
　　1.通過分別使用RF

4、P標(biāo)記的F5M2和 F4細(xì)胞作為CTCs建立CTCs自我種植模型，冰凍切片熒光顯微鏡觀察分析不同轉(zhuǎn)移潛能的骨肉瘤細(xì)胞作為CTCs發(fā)生自我種植的效率有無差異。
　　2.通過siRNA技術(shù)下調(diào)F5M2細(xì)胞中IL-6R的表達(dá)，然后使用Transwell迀移實(shí)驗(yàn)觀察SOSP-9607細(xì)胞條件培養(yǎng)基對F5M2細(xì)胞促遷移作用的變化。
　　3.通過ICC、qRT-PCR和Western Blot等技術(shù)鑒定骨肉瘤細(xì)胞中IL-6的表達(dá)情況，然

5、后通過使用shRNA技術(shù)穩(wěn)定下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞SOSP-9607和F5M2中IL-6的表達(dá)。
　　4.通過MTT檢測、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移/侵襲檢測等一系列體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)對穩(wěn)定下調(diào)IL-6表達(dá)后骨肉瘤細(xì)胞在增殖、迀移和侵襲等生物學(xué)特性方面的變化進(jìn)行了檢測。
　　5.通過使用穩(wěn)定下調(diào)IL-6表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞系建立骨肉瘤原位荷瘤裸鼠模型，觀察其原位腫瘤的生長情況和自發(fā)肺轉(zhuǎn)移情況的變化。
　　6.通過West

6、ern Blot技術(shù)檢測rhIL-6潛在激活的信號通路，然后通過使用通路關(guān)鍵蛋白的抑制劑進(jìn)行M T T檢測、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)等檢測相關(guān)通路在IL-6刺激骨肉瘤細(xì)胞后發(fā)揮的具體調(diào)節(jié)作用。
　　7.通過使用穩(wěn)定下調(diào)IL-6表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞系建立CTCs自我種植模型或者是使用STAT3抑制劑Cryptotanshinone作用于CTCs自我種植模型，觀察CTCs自我種植模型中自我種植效率的變化。
　　8.通過免疫組織化學(xué)

7、染色技術(shù)對術(shù)后復(fù)發(fā)的骨肉瘤患者和初次手術(shù)的骨肉瘤患者的腫瘤樣本分別進(jìn)行IL-6表達(dá)的檢測與評估。
　　結(jié)果：
　　1高轉(zhuǎn)移潛能的RFP-F5M2細(xì)胞較低轉(zhuǎn)移潛能的RFP-F4細(xì)胞具有更高效率的CTCs自我種植。
　　2.下調(diào)F5M2細(xì)胞的IL-6R表達(dá)后，SOSP-9607細(xì)胞條件培養(yǎng)基對F5M2細(xì)胞的促迀移作用顯著降低。
　　3.骨肉瘤細(xì)胞顯著表達(dá)IL-6,同時(shí)建立了穩(wěn)定下調(diào)IL-6表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞系9607-

8、shIL-6和 F5M2-shIL-6.
　　4.穩(wěn)定下調(diào)F5M2細(xì)胞和SOSP-9607細(xì)胞中IL-6的表達(dá)后，這兩種骨肉瘤細(xì)胞在體外細(xì)胞學(xué)水平上的增殖、迀移和侵襲能力均顯著降低。
　　5.穩(wěn)定下調(diào)F5M2細(xì)胞和SOSP-9607細(xì)胞中IL-6的表達(dá)后，這兩種骨肉瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長和自發(fā)肺轉(zhuǎn)移均受到顯著抑制。
　　6.rhIL-6涉及激活F5M2細(xì)胞的JAK/STAT3和MAPK/ERK1/2信號通路，其中兩通路

9、均參與骨肉瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控，而僅有JAK/STAT3信號通路在IL-6的促細(xì)胞遷移作用中發(fā)揮作用。
　　7.無論是下調(diào)原位骨肉瘤中IL-6的表達(dá)還是使用針對IL-6激活的STAT3信號通路的抑制劑Cryptotanshinone進(jìn)行處理，均能夠顯著抑制原位骨肉瘤中CTCs自我種植的發(fā)生。
　　8.在骨肉瘤術(shù)后復(fù)發(fā)患者的臨床標(biāo)本中IL-6高表達(dá)所占的比例要顯著高于對照初次手術(shù)的患者，而且分析發(fā)現(xiàn)IL-6高表達(dá)與骨肉瘤患者的術(shù)后