KLF8在調(diào)控人骨肉瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲中的作用.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma，os)是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，多發(fā)生于兒童和青少年發(fā)育時(shí)期。通過(guò)手術(shù)治療后，發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤病人的術(shù)后五年存活率普遍低于20％。骨肉瘤如果不及時(shí)治療，往往會(huì)在6至12個(gè)月內(nèi)通過(guò)血行轉(zhuǎn)移的方式發(fā)生肺轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，這已經(jīng)成為骨肉瘤臨床觀察中，最為顯著的特征之一，也是影響病人預(yù)后的主要因素。
　　KLF8(Krüppel-like factor8)是KLF轉(zhuǎn)錄因子家族第一亞群的一員。KLF家族在N末端均

2、具有三個(gè)高度保守的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)，可以特異結(jié)合富含GC的啟動(dòng)子區(qū)。KLF轉(zhuǎn)錄因子在人類生長(zhǎng)發(fā)育以及各種疾病包括腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。KLF8被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。KLF8是調(diào)控細(xì)胞周期的重要轉(zhuǎn)錄因子，其在致癌性轉(zhuǎn)化(oncogenic transformation)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)中具有關(guān)鍵作用。雖然關(guān)于KLF8在腫瘤中的功能已有不

3、少的研究，但KLF8在人骨肉瘤中的功能還未見詳盡報(bào)道。本研究的目的就是探討KLF8在Saos-2骨肉瘤細(xì)胞中尤其是細(xì)胞侵襲中的生物學(xué)作用。
　　首先通過(guò)RT-PCR(real-time PCR)和western blotting實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)KLF8在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常成骨細(xì)胞中的表達(dá)，且惡性越高、侵襲性越強(qiáng)的細(xì)胞，KLF8的表達(dá)量越高。同時(shí)對(duì)骨肉瘤病理組織的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤原發(fā)灶KLF8表達(dá)高于癌旁組織,但低于肺轉(zhuǎn)移灶

4、。通過(guò)構(gòu)建沉默KLF8基因表達(dá)的shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染入Saos-2細(xì)胞，以隨機(jī)合成的shRNA作為陰性對(duì)照，QRT-PCR及WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在高惡性骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2細(xì)胞中成功沉默了KLF8基因的表達(dá)，顯著下調(diào)了KLF8的mRNA和蛋白水平。
　　構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)KLF8-shRNA的Saos-2細(xì)胞，分析了KLF8基因的沉默對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)增殖的影響。首先用MTT方法測(cè)定細(xì)胞增殖情況。同陰性對(duì)照細(xì)胞相比，shRNA-KLF8

5、組的細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對(duì)照細(xì)胞，說(shuō)明KLF8的沉默抑制了細(xì)胞的增殖。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KLF8表達(dá)降低的細(xì)胞形成克隆數(shù)明顯少于對(duì)照細(xì)胞，說(shuō)明KLF8影響了細(xì)胞的群體依賴性和克隆形成能力。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)KLF8的沉默使骨肉瘤細(xì)胞在G0/G1期停滯，且細(xì)胞凋亡率顯著提高。說(shuō)明KLF8對(duì)細(xì)胞增殖的影響是通過(guò)使細(xì)胞周期停滯和增加細(xì)胞凋亡兩方面來(lái)完成的。
　　通過(guò)Transwell@細(xì)胞侵襲