低氧條件下BNIP3對表皮細胞遷移的影響及其機制研究.pdf

1、創(chuàng)面愈合是在多種組織和細胞協(xié)同作用下共同完成的精密調控的過程。再上皮化是創(chuàng)面愈合進程中早期啟動的生物學事件，在重建皮膚機械屏障的完整性中發(fā)揮重要作用，而表皮細胞遷移是貫穿于這一過程的關鍵步驟，已成為創(chuàng)面愈合研究的焦點。但低氧微環(huán)境對創(chuàng)面愈合過程中皮膚表皮細胞遷移是否具有調控作用及其分子調控機制，迄今均未完全闡明。
　　BNIP3（Bcl-2 nineteen-kilodalton interacting protein3）是僅含有

2、非典型BH3結構域的Bcl-2蛋白質家族的成員之一，是一種低氧反應蛋白。大量文獻證實BNIP3參與細胞增殖、凋亡、自噬、分化等生物學行為的調節(jié)，并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展，心肌肥大與萎縮，腦缺血缺氧損害等多種疾病過程中發(fā)揮重要作用。BNIP3分布在人表皮細胞中，并參與調控其分化并維持其自穩(wěn)態(tài)。但BNIP3對表皮細胞遷移是否具有調控作用，目前尚無相關文獻報道。
　　創(chuàng)面形成后，多種信號通路激活并動員創(chuàng)面修復細胞，加速創(chuàng)面再上皮化進程。黏著

3、斑激酶(FAK)是分布于細胞質中的一種酪氨酸蛋白激酶，在整合素家族調控細胞運動中發(fā)揮核心作用，主要通過397號位點的酪氨酸自磷酸化而激活。大量文獻資料表明FAK參與創(chuàng)面愈合過程中表皮細胞遷移的調控。特異性的整合素單克隆抗體的應用可下調FAK的活化水平并抑制表皮細胞遷移;FAK缺失的小鼠創(chuàng)面愈合明顯延遲，這與FAK的活化受阻密切相關。在多種腫瘤中，F(xiàn)AK信號轉到途徑及其下游信號參與調節(jié)肌動蛋白細胞骨架的聚合、解聚及重排等細胞遷移相關的關鍵

4、環(huán)節(jié)，而BNIP3可以調節(jié)細胞肌動蛋白骨架的重構。因此我們推測，F(xiàn)AK可能參與了BNIP3對表皮細胞遷移的調控。
　　在多種哺乳動物細胞的研究中發(fā)現(xiàn)BNIP3可通過其BH3結構域競爭Bcl-2與Beclin-1的結合位點破壞Bcl-2/Beclin-1的穩(wěn)定結合，從而啟動自噬(Autophagy)。自噬是真核細胞中高度保守的一種溶酶體降解途徑，在維持機體的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。功能學上，自噬參與調控多種生理及病理過程，如生長發(fā)育、炎

5、癥反應、腫瘤的發(fā)生與侵襲轉移等。近年來，表皮細胞自噬的生物學意義也受到了廣泛關注。某些具有生物活性的物質或理化因素可誘導表皮細胞自噬;自噬參與調控表皮細胞分化;自噬可減少紫外線照射引起的表皮細胞損傷，促進其存活。然而，自噬對表皮細胞遷移的影響尚缺乏研究證據(jù)。
　　目的：
　　本研究提出低氧條件下BNIP3通過調節(jié)FAK或自噬進而調控創(chuàng)面愈合過程中表皮細胞遷移的假設，通過檢測低氧條件下BNIP3對表皮細胞遷移的影響，并探討其對

6、表皮細胞FAK及自噬的調節(jié)，從而明確BNIP3調節(jié)表皮細胞遷移的作用機制。
　　方法：
　　1.建立體外低氧培養(yǎng)的小鼠原代表皮細胞模型，模擬創(chuàng)面低氧微環(huán)境，觀察低氧(2％O2:3h、6h、9h)處理前后表皮細胞運動性和遷移及BNIP3蛋白表達的變化規(guī)律;
　　2.通過siRNA轉染技術構建BNIP3下調的小鼠原代表皮細胞模型并進行低氧處理(2％O2:6h)，WB檢測siRNA轉染的有效性;在活細胞工作站下觀察BNIP3

7、下調對表皮細胞運動性的影響;體外片層細胞劃痕實驗模擬創(chuàng)面愈合過程，觀察BNIP3下調對表皮細胞遷移的影響，從而明確低氧條件下BNIP3對表皮細胞遷移的調控作用;
　　3.通過WB檢測低氧(2％O2:3h、6h、9h)處理前后表皮細胞中p-FAK表達及自噬的變化;并檢測低氧條件下BNIP3下調對表皮細胞FAK及自噬的影響;通過TAE226選擇性抑制FAK的活化檢測低氧條件下FAK對表皮細胞運動性及遷移的調控;最后，在常氧條件下用雷帕

8、霉素激活自噬，檢測自噬對表皮細胞運動性及遷移的影響，從而初步明確低氧條件下BNIP3調控表皮細胞遷移的可能作用機理。
　　結果：
　　1.低氧促進小鼠原代表皮細胞的運動性及遷移，并顯著上調BNIP3的表達，且隨低氧處理時間延長呈上升趨勢，這與表皮細胞運動性隨低氧處理時間變化的規(guī)律基本契合;
　　2.應用靶向BNIP3的siRNA序列下調BNIP3，通過單個細胞運動性檢測（活細胞工作站觀察）及體外細胞劃痕實驗，我們發(fā)現(xiàn)B

9、NIP3的下調可有效地逆轉低氧對表皮細胞運動性及遷移的促進作用，說明BNIP3參與調控低氧促進的表皮細胞遷移;
　　3.低氧處理促進FAK的活化，并使自噬標志物LC3-Ⅱ、p62顯著上調;低氧條件下用siRNA轉染下調BNIP3可顯著抑制FAK信號通路的激活，并且抑制FAK的活性可逆轉低氧表皮細胞遷移的促進作用，說明FAK信號通路參與了低氧條件下BNIP3介導的表皮細胞遷移;低氧條件下下調BNIP3可顯著抑制LC3-Ⅱ的上調，說明

10、低氧條件下BNIP3對表皮細胞自噬具有調控作用;但盡管常氧條件下雷帕霉素可顯著抑制表皮細胞遷移，雷帕霉素模擬的自噬與低氧處理誘導的自噬不盡相同，要明確BNIP3是否通過自噬調節(jié)表皮細胞遷移尚需要進一步研究。
　　結論：
　　低氧上調表皮細胞中BNIP3的表達，并促進FAK信號通路的的活化，從而促進表皮細胞遷移;同時低氧可激活自噬，但自噬是否參與低氧條件下BNIP3對表皮細胞遷移的調控尚需進一步研究。
　　本研究首次明確