離體條件下低氧環(huán)境對(duì)破骨細(xì)胞生成及功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【研究背景】骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征，致使骨強(qiáng)度降低、骨脆性增加，易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。隨著世界人口的老齡化，骨質(zhì)疏松已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。目前全世界約有2億人患骨質(zhì)疏松癥，其發(fā)病率已躍居常見(jiàn)病、多發(fā)病第七位。我國(guó)于1999年進(jìn)入老齡化社會(huì)，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前已有八千八百萬(wàn)名患者，預(yù)計(jì)到今年年底將超過(guò)一億。中國(guó)內(nèi)地總患病率為百分之十二點(diǎn)四，老年

2、人中患病比例超過(guò)一半以上，其中骨折發(fā)生率接近三分之一，骨質(zhì)疏松不僅影響患者的生活質(zhì)量，而且可導(dǎo)致脊柱、四肢等部位的骨折。年齡越大，骨折的風(fēng)險(xiǎn)性越高，該病引起的致殘率、致死率較高。 我國(guó)西部省區(qū)地處高原，約占全國(guó)陸地面積的一半，人口4億多，占全國(guó)總?cè)丝诮种?。高原地區(qū)由于海拔高，空氣含氧量明顯低于平原，特殊的高原環(huán)境對(duì)骨代謝的影響的研究結(jié)果顯示：高原干燥、缺氧的環(huán)境對(duì)骨代謝有影響，平原人群到高原后不久會(huì)引起骨量丟失，在高原發(fā)生

3、骨折會(huì)引起延遲愈合甚至不愈合。與低海拔地區(qū)相比，高海拔地區(qū)骨吸收增加，骨量減少。 大量的研究表明表達(dá)于干細(xì)胞和成骨細(xì)胞表面的腫瘤壞死因子受體家族的NF-kB受體活化因子配體(Receptor activator of NF-kB ligand，RANKL)和護(hù)骨素(osteoprotegerin，OPG)在破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)中起著重要的作用，許多局部因子通過(guò)調(diào)控OPG、RANKL和NF-kB受體活化因子(Receptor acti

4、vator of NF-kB，RANK)之間的比例，介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成并維持其功能。本研究從體外模擬低氧環(huán)境入手，探討不同低氧濃度對(duì)破骨細(xì)胞生成及骨吸收功能的影響，試圖從分子水平揭示低氧對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響的可能機(jī)制，探討低氧引起骨量丟失的可能的分子機(jī)制。 【目的】通過(guò)在體外模擬不同海拔高度的低氧環(huán)境，觀察不同氧濃度在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能的影響。 【方法】取出生2天內(nèi)的新生小鼠，取其顱蓋骨用組

5、織塊法培養(yǎng)成骨細(xì)胞，純化后傳代。取6～9周齡小鼠骨髓細(xì)胞，用含I，25(OH)<,2>D<,3>(10<'-8>mol/L)、地塞米松(10<'-8>mol/L)分化培養(yǎng)基在模擬不同海拔高度的氧濃度中培養(yǎng)。骨髓細(xì)胞純化后加入第3～5代成骨細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，隨機(jī)分組，每組樣本數(shù)為4，選擇不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)，每項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)3次。用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)OPG、RANK及RANKL mRNA的

6、表達(dá)；用Westernblotting檢測(cè)RANK蛋白的表達(dá)情況。缺氧48小時(shí)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠破骨細(xì)胞的細(xì)胞周期；用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色和在骨片上形成骨吸收陷窩作為破骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志，利用酶動(dòng)力方法測(cè)定培養(yǎng)上清液中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性。將小鼠骨髓細(xì)胞接種到無(wú)菌骨片上，隨機(jī)放入不同氧濃度的低氧環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，7天后取出，將骨片進(jìn)

7、行甲苯胺藍(lán)染色，采用Olympus倒置光相差顯微鏡計(jì)數(shù)TRAP染色陽(yáng)性多核細(xì)胞的數(shù)目；掃描電鏡掃描骨吸收陷窩，通過(guò)Leica Quantimet 500圖像分析儀處理不同低氧環(huán)境下破骨細(xì)胞所形成骨吸收陷窩數(shù)目及面積。 【結(jié)果】 1、氧濃度及缺氧時(shí)間對(duì)前破骨細(xì)胞上RANKmRNA和RANK蛋白的表達(dá)有顯著影響(P<0.01)。缺氧第1天，各低氧組與常氧組相比無(wú)明顯差異；缺氧第3天，各低氧組RANKmRNA和RANK蛋白的表

8、達(dá)較常氧組增加(P<0.05)，但各低氧組之間無(wú)明顯差異；缺氧第5天，各低氧組RANKmRNA和RANK蛋白的表達(dá)較常氧組顯著增加(P<0.01)，其中3％氧濃度時(shí)表達(dá)增加最明顯；缺氧第7天，各低氧組RANKmRNA和RANK蛋白的表達(dá)較常氧組顯著增加(P<0.01)，但與第5天相比，RANKmRNA和RANK蛋白的表達(dá)相對(duì)減弱。 2、氧濃度及缺氧時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞上RANKLmRNA的表達(dá)有顯著影響(P<0.01)。缺氧第1天，與

9、常氧組相比，各低氧組RANKLmRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)，但各低氧組之間無(wú)明顯差異；缺氧第3天，與常氧組相比，各低氧組RANKLmRNA的表達(dá)顯著增加，以3％氧濃度升高最顯著；在缺氧第5，7天，與常氧組相比，RANKLmRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.01)，但與前三天相比，其表達(dá)較前減弱。 3、氧濃度及缺氧時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞上OPGmRNA的表達(dá)有顯著影響(P<0.01)。在缺氧第1天，與常氧組相比，各低氧組OPGmRNA

10、表達(dá)明顯減低(P<0.01)，但各低氧組之間無(wú)明顯差異；在缺氧第3天，與常氧組相比，各低氧組OPGmRNA表達(dá)明顯減低(P<0.01)，3％、1％氧濃度較6％氧濃度減低更明顯，但二者之間無(wú)明顯差異。在缺氧第5，7天，與常氧組相比，各低氧組OPGmRNA表達(dá)顯著減低，且各低氧組之間的差異顯著，以1％氧濃度減低最明顯。 4、隨著氧濃度降低，骨吸收陷窩數(shù)目由7.58±1.08個(gè)/骨片升至9.67±0.98，12.50±1.45，11.

11、00±0.85個(gè)/骨片(P<0.01)；骨吸收陷窩面積由341.86±195.46μm<'2>/個(gè)增至470.62±207.89，688.08±429.02，583.27±224.54 μm<'2>/個(gè)(P<0.01)；抗酒石酸酸性磷酸酶的酶活力由3.87±1.58IU/L升至4.99±0.25，7.40±0.53，6.1l±0.37IU/L(P<0.01)。 5、氧濃度對(duì)破骨細(xì)胞周期有影響。在G1期，常氧組與低氧組之間破骨細(xì)胞

12、細(xì)胞數(shù)含量比有明顯差異(P<0.01)，由81.13±1.31％減少到66.77±0.70％，73.60±0.76％和增加到84.87±1.60％；在G2期，常氧組與低氧組細(xì)胞數(shù)含量比有明顯差異(P<0.01)，由8.57±0.48％增加到13.13±3.18％，14.20±0.44％和11.10±3.08％；在S期，常氧組細(xì)胞數(shù)含量比有明顯差異(P<0.01)，由10.63±1.17％升至20.17±3.36％，12.20±0.33％

13、，1％氧濃度時(shí)降至6.56±0.39％。 6、隨著氧濃度的降低，200倍光鏡下觀察到的抗酒石酸酸性磷酸酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目由3.30±0.45個(gè)/玻片增加到6.10±0.55，7.90±0.42，5.00±0.61個(gè)/玻片(P<0.01)。 【結(jié)論】 1、氧濃度及缺氧時(shí)間對(duì)小鼠破骨細(xì)胞生成有顯著影響。隨著氧濃度降低，前破骨細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化明顯增加，與常氧組相比，破骨細(xì)胞核數(shù)增多，體積增大，以3％氧濃度增加最明顯；隨

14、著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，破骨細(xì)胞生成逐漸增多，以缺氧第5天增加最明顯，以后隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)破骨細(xì)胞生成相對(duì)減弱。 2、氧濃度對(duì)小鼠破骨細(xì)胞骨吸收功能有顯著影響，隨著氧濃度降低，破骨細(xì)胞骨吸收功能逐漸增強(qiáng)，尤其在3％氧濃度時(shí)，破骨細(xì)胞骨吸收功能達(dá)到高峰，以后隨著氧濃度降低骨吸收功能相對(duì)減弱。 3、隨著氧濃度降低，RANKL基因的表達(dá)先增多后減弱，OPG基因的表達(dá)隨著氧濃度降低而降低，且呈時(shí)間依賴性，RANK基因的表達(dá)隨著氧濃度的降