低氧條件下間充質(zhì)干細胞對胰島細胞的保護作用及其機制研究.pdf

1、背景：
　　胰島移植是治療Ⅰ型糖尿病的重要手段。但是在移植的早期由于各種非免疫性的因素的作用,大約有50％的胰島細胞發(fā)生凋亡和壞死。在胰島細胞的分離、提取過程中,大量的胰島外周毛細血管被破壞,使得胰島細胞在分離、保存及移植的早期處于嚴重的低氧狀態(tài)。而胰島細胞本身對于氧分壓十分敏感,因此低氧可能是導致早期移植物丟失的主要原因。間充質(zhì)干細胞由于具有組織修復和支持功能因而被廣泛應用于胰島移植。大量研究表明間充質(zhì)干細胞可以通過分泌大量保護

2、性生長因子減輕炎癥反應和免疫排斥反應,加快血管新生,促進移植物的存活。但是目前對于間充質(zhì)干細胞保護胰島細胞方式(直接或是間接)尚不明確,其具體機制研究較少。
　　目的：
　　本實驗利用體外直接接觸和間接接觸(transwell小室模型)的培養(yǎng)方法和體內(nèi)實驗探討了低氧條件下間充質(zhì)干細胞保護胰島細胞的相關機制。
　　方法：
　　1、取 F344大鼠股骨,反復沖洗得到骨髓內(nèi)的細胞,經(jīng)反復貼壁離心,傳代至3-6代得到實驗

3、用大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。通過流式細胞儀,ELISA,von kossa和油紅O染色對獲得的間充質(zhì)干細胞形態(tài)、表面標記物及功能進行鑒定。通過逆行經(jīng)膽管灌注酶解法,histopaque1077密度梯度離心法提取大鼠F344的胰島細胞,行ELISA檢測功能。
　　2、將間充質(zhì)干細胞與胰島細胞在低氧條件下共培養(yǎng)24h,實驗分組:單獨胰島組,直接接觸共培養(yǎng)組和間接接觸共培養(yǎng)組(transwell小室將兩者分離),另設置常氧下胰島組作為對照。

4、利用ELISA檢測胰島細胞的分泌功能,TUNEL和流式細胞儀的方法檢測細胞的凋亡和壞死情況。
　　3、將提取得到的F344大鼠的胰島與間充質(zhì)干細胞移植入裸小鼠左腎被膜下。實驗分組單獨胰島組(胰島細胞移植入左腎下極被膜,以血凝塊封堵),直接接觸組(預先將間充質(zhì)干細胞與胰島細胞混合后移植入左腎被下極被膜,以血凝塊封堵),間接接觸組(將胰島細胞移植入左腎下極被膜,將間充質(zhì)干細胞移植入左腎上極被膜,以血凝塊封堵隔離),另有單獨移植間充質(zhì)干

5、細胞于左腎上極的對照組。移植后定期檢測血糖水平21天。為進一步研究間充質(zhì)干細胞對于早期移植物的保護作用機制,相同的實驗分組,于移植后48小時取移植腎臟,行免疫熒光化學染色和實時定量PCR檢測。
　　4、將GFP標記的間充質(zhì)干細胞與胰島細胞系INS-1在低氧條件下共培養(yǎng)24h,實驗分組:單獨胰島組,直接接觸共培養(yǎng)組和間接接觸共培養(yǎng)組(transwell小室將兩者分離),另設置常氧下胰島組作為對照。通過免疫細胞熒光化學染色,weste

6、rn blot和實時定量PCR的方法進行檢測相關指標。
　　結果：
　　1、通過反復貼壁離心法,得到間充質(zhì)干細胞。經(jīng)流式細胞儀進行表面標記物的鑒定,干細胞表面CD29、CD105、CD90高表達,而低表達造血細胞的標記物如 CD34、CD45、 CD80;ELISA檢測分泌IGF-1,HGF,VEGF;具有成骨、成脂多向分化能力。光鏡下觀察胰島細胞的形態(tài)并計數(shù),ELISA的結果提示胰島分泌功能良好。
　　2、ELISA

7、結果提示:間充質(zhì)干細胞能夠通過直接接觸的方式保護低氧條件下胰島細胞的分泌功能,而間接接觸保護作用并不明顯。TUNEL和流式細胞結果提示:間充質(zhì)干細胞能夠通過直接接觸的方式提高低氧條件下的胰島細胞的存活。
　　3、將間充質(zhì)干細胞與胰島細胞以直接接觸的方式進行移植,可以明顯改善胰島移植物功能,提高移植效率。免疫熒光結果提示:直接接觸組中,間充質(zhì)干細胞能夠保護移植早期胰島細胞內(nèi)PDX-1的表達。
　　4、免疫熒光染色、wester

8、n blot及實時定量PCR的結果提示間充質(zhì)干細胞能夠通過直接接觸的方式抑制低氧條件胰島細胞內(nèi)NF-κB及其下游靶基因的活化,進而上調(diào)胰島素上游調(diào)控基因PDX-1和Mafa的表達。細胞間的粘附蛋白E-cadherin可能參與了此過程。
　　結論：
　　間充質(zhì)干細胞能夠以直接接觸的方式保護低氧條件下胰島細胞的功能并提高胰島細胞存活率。其機制可能是間充質(zhì)干細胞通過直接接觸的方式抑制低氧條件下胰島細胞的NF-κB及其下游靶基因的活