低氧環(huán)境調(diào)控下的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞改善胰島移植物功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖尿病是人類健康與生命安全的一大威脅，其發(fā)病率近幾年來呈不斷上升趨勢，預(yù)計(jì)中國糖尿病人數(shù)到2025年將達(dá)3760萬，躍居世界第一。1型糖尿病與自身免疫相關(guān)，通過免疫反應(yīng)破壞胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分泌不足，對(duì)外源性胰島素依賴嚴(yán)重，常出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥。盡管豐富便捷的胰島素制劑為1型糖尿病患者的血糖控制提供了很大幫助，但仍然面臨著胰島素抵抗和致死性低血糖的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)對(duì)血糖的調(diào)控缺乏及時(shí)性和精確性。胰島移植重建內(nèi)源性血糖調(diào)控系統(tǒng)是克服上述缺點(diǎn)徹

2、底治愈1型糖尿病的理想方案。免疫損傷以及缺血缺氧等引起的移植物原發(fā)性無功能是目前胰島移植所面臨的最大障礙。本研究的目的是尋找一種保護(hù)移植胰島，降低移植物原發(fā)性無功能的方法，以提高移植的成功率。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類多能干細(xì)胞，它具有無限增殖、多向分化的能力。組織工程學(xué)上常用它作為修補(bǔ)缺損、彌補(bǔ)功能的種子細(xì)胞。它是造血微環(huán)境的重要組成部分，能夠強(qiáng)烈地刺激造血，促進(jìn)血管新生。同時(shí)它能合成多種活性細(xì)胞因子，通過旁分泌作用其它細(xì)

3、胞，保護(hù)目的細(xì)胞。并且在低氧環(huán)境的刺激下，其增殖、分化和分泌功能都有不同程度的增強(qiáng)。
　　 我們的研究設(shè)想通過原代分離得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用低氧刺激增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，與原代分離得到的胰島于體外輔助培養(yǎng)、體內(nèi)聯(lián)合移植，以探討其作為胰島移植的輔助支持細(xì)胞的有效性和可行性。為克服移植物原發(fā)性無功能和供體緊缺的困難提供一定的理論依據(jù)。
　　 第1章：小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：

4、建立小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、純化及培養(yǎng)的方法，并鑒定其生物學(xué)特性。
　　 方法：通過全骨髓貼壁法得到含雜細(xì)胞的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，通過特殊培養(yǎng)基選擇性優(yōu)勢生長后純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；通過MTT法建立其生長曲線；通過流式鑒定其表面CD標(biāo)志；并通過特殊成脂肪分化培養(yǎng)基鑒定其分化能力。
　　 結(jié)果：大部分細(xì)胞于24h內(nèi)貼壁，傳代3代以上后形態(tài)趨于一致，呈成纖維細(xì)胞樣。細(xì)胞大致4天為一個(gè)生長高峰，第3代子細(xì)胞和第6代子代細(xì)

5、胞在生長速度上有差異。子1代小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面CD29和CD71陽性，CD34陰性，CD45弱陽性，CD90陰性。傳代后，CD29和CD71陽性率顯著上升，CD34仍然陰性，CD45陽性率逐漸減弱。經(jīng)特殊培養(yǎng)其誘導(dǎo)3周后細(xì)胞變圓，出現(xiàn)空泡，內(nèi)出現(xiàn)脂滴，油紅染色呈亮紅色。
　　 第2章：低氧環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響
　　 目的：比較小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外缺氧培養(yǎng)和正常氧濃度培養(yǎng)的差異。
　　 方法：通過

6、全骨髓貼壁法、特殊培養(yǎng)基篩選法得到相同供體來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，分別培養(yǎng)于20％O2和5％02的環(huán)境中；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法建立不同環(huán)境下的生長曲線；通過流式鑒定不同條件培養(yǎng)之下的細(xì)胞表面標(biāo)志；并通過特殊成脂肪分化培養(yǎng)基鑒定不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞分化能力；PT-qPCR和ELISA分別從基因水平和分泌蛋白水平檢測兩者VEGF、IL-6、MCP-1和MMP-9的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：低氧環(huán)境中大部分細(xì)胞于24h內(nèi)貼壁，通過2次傳代后

7、形態(tài)基本趨于一致，呈成纖維細(xì)樣。低氧培養(yǎng)的細(xì)胞生長速度明顯優(yōu)于正常培養(yǎng)的細(xì)胞。低氧培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面CD29和CD71陽性，CD34陰性，CD45弱陽性，CD90陰性，與正常培養(yǎng)的細(xì)胞類似。低氧刺激后的細(xì)胞經(jīng)特殊培養(yǎng)基誘導(dǎo)后亦變圓，出現(xiàn)空泡，內(nèi)出現(xiàn)脂滴，油紅染色呈亮紅色?；蛩缴系脱跖囵B(yǎng)的細(xì)胞VEGF、IL-6、MCP-1和MMP-9的表達(dá)都明顯高于正常狀態(tài)下的細(xì)胞，分泌蛋白水平上低氧培養(yǎng)的細(xì)胞VEGF明顯要高得多，IL-6略

8、高，MCP-1和MMP-9反而低。
　　 第3章：小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外對(duì)活體胰島的保護(hù)作用
　　 目的：探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外對(duì)胰島的保護(hù)作用。
　　 方法：分離得到相同供體來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，代替以胰島培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)于20％03和5％03的環(huán)境中48h，制備條件培養(yǎng)基；通過Ⅳ型膠原酶消化法結(jié)合密度梯度離心法分離純化小鼠胰島；用普通培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基分別在20％02和1％O2的環(huán)境中培養(yǎng)胰島，A

9、O/PI染色鑒定其凋亡情況，打散胰島細(xì)胞團(tuán)用流式檢測其死亡率；前后用不同濃度的葡萄糖刺激所獲得的胰島，并通過放免方法檢測不同培養(yǎng)基在不同的氧濃度條件下培養(yǎng)的胰島的胰島素釋放能力。
　　 結(jié)果：IV膠原酶消化加密度梯度離心后在20％和23％Ficoll界面層獲得胰島，純度在85％以上，活力良好。條件培養(yǎng)基尤其是低氧培養(yǎng)BM-MSCs獲得的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)胰島后，AO/PI染色顯示胰島在低氧環(huán)境中耐受良好，形態(tài)完整，凋亡細(xì)胞少，流式檢

10、測死亡率低，整體明顯優(yōu)于普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的胰島。條件培養(yǎng)基尤其是低氧培養(yǎng)BM-MSCs獲得的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的胰島，在前后不同葡萄糖濃度的刺激下，其胰島素釋放量要明顯高于普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的胰島。
　　 第4章：小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與活體胰島聯(lián)合移植研究
　　 目的：探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)對(duì)胰島的保護(hù)作用。
　　 方法：STZ腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病模型建立；分離得到的胰島按不同劑量(250、300、350和400IEQ

11、）分別移植于小鼠腎包膜下，于移植后30天內(nèi)定期觀察受體鼠體重、非禁食血糖和禁食后血糖的變化；相同供體來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別培養(yǎng)于20％03和5％03的環(huán)境中48h后，各自按1×10~6的數(shù)量與250或300IEQ胰島聯(lián)合移植于腎包膜下，移植后1月內(nèi)，定期觀察各組體重、非禁食血糖和禁食后血糖變化；各實(shí)驗(yàn)組受體鼠在觀察期結(jié)束之后，用10％葡萄糖灌胃行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：STZ腹腔注射成模率在70％作用。400IEQ能使

12、糖尿病小鼠血糖10天完全降到正常，之后一直穩(wěn)定在正常水平。250、300和350IEQ都有一定的降血糖作用，但血糖水平無法到達(dá)正常。低氧培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和250IEQ聯(lián)合移植可以達(dá)到400IEQ單獨(dú)移植的效果。正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和300IEQ聯(lián)合移植亦可達(dá)到400IEQ單獨(dú)移植的效果。低氧培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和250IEQ聯(lián)合移植、正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和300IEQ聯(lián)合移植后的受體鼠糖耐量完全趨于正常。
　　

13、 全文結(jié)論：
　　 1、全骨髓貼壁法結(jié)合特殊培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)可以獲得高純度的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2、所獲得的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全具備其相應(yīng)的生物學(xué)特性。
　　 3、低氧培養(yǎng)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞亦完全具備相應(yīng)的生物學(xué)特性，但在增殖速度和VEGF的表達(dá)上要明顯優(yōu)于正常氧濃度培養(yǎng)的細(xì)胞。
　　 4、IV膠原酶消化加密度梯度離心法可以獲得高純度的小鼠胰島。
　　 5、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞尤其