ADMC的藥理活性及作用機制研究.pdf

1、目的：通過對一系列香豆素類化合物免疫抑制、抗炎及降糖活性的篩選，找到一種活性較強的化合物即ADMC，并進一步研究其免疫抑制及抗炎作用的機制，旨在找到其作用靶點及發(fā)揮免疫抑制與抗炎作用之間的關(guān)聯(lián)。為了進一步發(fā)現(xiàn)這種香豆素的其他藥理活性，對其進行了抗癌活性篩選，為此化合物的新藥開發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　方法：首先，利用T/B淋巴細胞增殖實驗對12種香豆素衍生物進行免疫抑制活性研究，并根據(jù)不同藥物濃度對ConA誘導的T淋巴細胞增殖、L

2、PS誘導的B淋巴細胞增殖的抑制率計算出各個化合物的IC50值；根據(jù)各個化合物對LPS刺激的小鼠巨噬細胞系RAW264.7分泌NO的抑制作用篩選其抗炎活性；以HepG2細胞的葡萄糖吸收為模型篩選各個化合物的對糖消耗的活性；將12種化合物的藥理活性進行對比發(fā)現(xiàn)3-乙?；?6,7-二甲氧基香豆素（ADMC）藥理作用廣泛且藥效較強。其次，對ADMC的免疫抑制及抗炎作用進行深入研究，以ConA刺激的T淋巴細胞、LPS刺激的B淋巴細胞、髓來源DC、

3、RAW264.7細胞、人單核細胞THP-1為研究對象，F(xiàn)ACS檢測其對T/B細胞周期及凋亡的影響，以及B細胞、DC細胞表型的影響；檢測其對RAW264.7細胞上清液中細胞因子分泌的影響，熒光定量 PCR及免疫印跡檢測其對相關(guān)基因蛋白表達的影響，顯微鏡下觀察THP-1細胞單核-巨噬的轉(zhuǎn)化過程，F(xiàn)ACS檢測細胞分群及平均熒光強度以佐證ADMC對單核-巨噬轉(zhuǎn)化的影響。同時，建立LPS/D-GalN誘導的自身免疫性肝炎模型研究其體內(nèi)藥效，測定血

4、清ALT、AST及肝臟病理切片觀察其對肝功能的影響，檢測血清炎性因子的分泌及其對T、B細胞、DC及肝組織中CD8+T細胞這些免疫細胞的影響，通過qRT-PCR檢測肝臟組織中TLR4通路基因的表達，Western Blot檢測肝組織中TLR4蛋白及脾組織中TLR4及JAK2-STAT3蛋白。再次，建立ConA誘導的自身免疫性肝炎模型驗證其藥效，主要檢測其對肝功能及部分免疫細胞的影響。最后，采用MTT法檢測該化合物對Hela、HepG2、A

5、SPC-1、BXPC-3、MiaPaCa-2五種癌細胞系的抑制作用并利用SPSS19.0軟件計算IC50值，另外，以Hela細胞的裸鼠體內(nèi)移植為研究模型，通過裸鼠生存曲線及體重曲線圖觀測藥物對裸鼠生長、存活的影響，檢測ALT、AST肝功能指標并觀察肝臟組織中腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，研究藥物對腫瘤肝轉(zhuǎn)移的藥理作用。
　　結(jié)果：首先，ADMC對T/B淋巴細胞的體外增殖具有明顯的抑制作用，且對未增殖的脾淋巴細胞毒性較小，其發(fā)揮抑制作用的機理主要

6、是促進了T/B淋巴細胞的凋亡；在LPS刺激的RAW264.7細胞中，ADMC可明顯抑制NO，TNF-α的分泌，下調(diào)TLR4及其下游MyD88和TRIF的蛋白水平，同時抑制iNOS蛋白的表達；而在THP-1細胞單核-巨噬轉(zhuǎn)化的過程中，ADMC并未發(fā)揮明顯藥效；同時，ADMC對HepG2細胞在有無胰島素情況下的糖攝取均有顯著的促進作用。其次，ADMC在LPS/D-GalN誘導的自身免疫性肝炎模型中發(fā)揮了顯著的預防保護作用。其能顯著降低ALT

7、、AST水平，明顯減少肝組織部位的炎性浸潤，緩解肝組織損傷，對小鼠機體的免疫反應(yīng)具有顯著的抑制作用，其中明顯抑制T/B細胞的增殖，顯著減少血清中NO、TNF-α水平，對于主要發(fā)揮肝損傷作用的CD8+T細胞具有顯著的抑制作用。同時，對DC的遷移及成熟具有明顯的抑制作用，并促進其免疫抑制作用的發(fā)揮。ADMC顯著下調(diào)肝臟及脾臟組織中TLR4蛋白的表達水平，并對脾臟中JAK2-STAT3蛋白表達水平及其活化具有明顯的抑制作用。再次，在ConA誘

8、導的自身免疫性急性肝損傷模型中驗證了ADMC的藥效。最后，ADMC對幾種癌細胞系具有明顯的抑制作用，并能顯著抑制Hela細胞裸鼠體內(nèi)移植模型中腫瘤向肝臟的轉(zhuǎn)移，明顯減少轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量，改善裸鼠的體重，提高其生存率，恢復其肝功能。
　　結(jié)論：ADMC具有廣泛的藥理活性，在體外發(fā)揮了顯著的免疫抑制、抗炎、降糖及抗腫瘤活性，其藥理活性的發(fā)揮可能與其誘導T/B淋巴細胞凋亡、降低TLR4與iNOS的蛋白表達水平、上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT4的