喉癌患者中醫(yī)體質(zhì)類型分析及痰瘀對喉癌裸鼠miRNA表達影響的研究.pdf

1、目的:
　　喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率較高，嚴重威脅著人民的生命健康。中醫(yī)體質(zhì)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性，目前關(guān)于體質(zhì)與喉癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的研究并不多見，探究與喉癌發(fā)生相關(guān)的中醫(yī)體質(zhì)類型，對于臨床中調(diào)整患者體質(zhì)偏頗，預防喉癌有著重要的意義。導師團隊經(jīng)過20多年的研究，逐步發(fā)現(xiàn)并證實了痰瘀相關(guān)證候（血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證）是喉癌形成的基本證型，揭示痰瘀相關(guān)證候與喉癌形成之間的基因?qū)W機制，有望為喉癌的藥物治

2、療提供準確靶點。本課題將通過臨床調(diào)查研究，探究喉癌患者的中醫(yī)體質(zhì)類型特點，為喉癌的早期預防提供依據(jù);其次，將通過實驗研究，觀察痰瘀相關(guān)證候?qū)戆┞闶竽[瘤生長的影響，并檢測miRNA在痰瘀相關(guān)證候裸鼠腫瘤模型上的差異表達情況，分析痰瘀相關(guān)證候影響喉鱗癌細胞增殖的基因?qū)W機制。
　　方法:
　　1.文獻研究
　　通過文獻回顧，總結(jié)中醫(yī)體質(zhì)的概念、分型、影響因素等，分析中醫(yī)體質(zhì)與發(fā)病的關(guān)系，回顧中醫(yī)體質(zhì)與惡性腫瘤關(guān)系的研究進展

3、。
　　2.臨床研究
　　根據(jù)國醫(yī)大師王琦教授的“體質(zhì)九分法”建立臨床病例觀察表，采用問卷調(diào)查法，根據(jù)嚴格的納排標準，納入喉癌組患者67例，來源于2014年1月-2017年2月期間在廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院就診并確診為喉癌的患者;對照組53例，來源于同期收集的廣州市白云區(qū)三元里社區(qū)健康居民。對兩組人群進行中醫(yī)體質(zhì)評分，建立數(shù)據(jù)庫，判斷兩組人群的中醫(yī)體質(zhì)類型，分析喉癌患者的中醫(yī)體質(zhì)特點。
　　3.實驗研究
　　將

4、Hep-2喉鱗癌細胞進行培養(yǎng)、傳代;制作痰瘀相關(guān)證候（血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證）裸鼠模型，并對模型進行評價;將生長狀態(tài)良好的Hep-2喉癌細胞接種到已造模成功的裸鼠右側(cè)腋窩部皮下，觀察各組裸鼠在體瘤生長情況;腫瘤取材后以MTT法檢測細胞活性，以高通量法檢測瘤體細胞中的miRNA表達情況，并通過實時定量PCR檢測目的基因表達情況。
　　成果:
　　1.臨床研究
　　對67例喉癌患者及53例健康對照組人群進行中醫(yī)體質(zhì)分析，

5、兩組人群的體質(zhì)類型總體比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），說明兩組人群體質(zhì)類型存在差異。同時，對每一體質(zhì)類型分別進行比較，發(fā)現(xiàn)喉癌組瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)人數(shù)明顯多于對照組(P＜0.05)，喉癌組平和質(zhì)人數(shù)明顯少于對照組(P＜0.05)。九種體質(zhì)類型中除平和質(zhì)外，其余八種皆為偏頗體質(zhì)。喉癌組中平和質(zhì)7例，占本組總?cè)藬?shù)的10.4％，偏頗體質(zhì)60例，占89.6％;對照組中平和質(zhì)27例，占本組總?cè)藬?shù)的50.9％，偏頗體質(zhì)26例，占49.1％。
　

6、　調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，八種偏頗體質(zhì)既可單獨出現(xiàn)，也可與其他偏頗體質(zhì)兼見，同時具有兩種及以上偏頗體質(zhì)者稱為兼夾體質(zhì)。喉癌組的60例偏頗體質(zhì)中，屬單一偏頗體質(zhì)者27例，占40.3％，屬兼夾體質(zhì)者33例，占49.3％;對照組的26例偏頗體質(zhì)中，屬單一偏頗體質(zhì)者11例，占20.8％，屬兼夾體質(zhì)者15例，占28.3％。喉癌組中瘀血質(zhì)24例（包括單一瘀血質(zhì)6例，瘀血質(zhì)兼其他偏頗體質(zhì)18例），對照組中瘀血質(zhì)3例（包括單一瘀血質(zhì)0，瘀血質(zhì)兼其他3例），兩者比較

7、有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。喉癌組中痰濕質(zhì)25例（包括單一痰濕質(zhì)3例，痰濕質(zhì)兼其他22例），對照組中痰濕質(zhì)6例（包括單一痰濕質(zhì)0，痰濕質(zhì)兼其他6例），兩者比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。其余六種體質(zhì)類型（氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、濕熱質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì)）分別比較，無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)為虛性體質(zhì)類型，將兩組虛性體質(zhì)者分別合并后，各體質(zhì)類型人數(shù)由多到少排序為:喉癌組，虛性體質(zhì)＞痰濕質(zhì)＞瘀血質(zhì)

8、＞濕熱質(zhì)＞氣郁質(zhì)＞平和質(zhì)＞特稟質(zhì);對照組，平和質(zhì)＞虛性體質(zhì)＞濕熱質(zhì)＞氣郁質(zhì)＞痰濕質(zhì)＞瘀血質(zhì)＞特稟質(zhì)。虛性體質(zhì)者在兩組人群中均占有較大比例，喉癌組46.3％，對照組32.1％。
　　2.實驗研究
　　(1)完成了痰瘀相關(guān)證候（血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證）裸小鼠模型的制作和評價:與對照組比較，血瘀證組裸小鼠出現(xiàn)了形體消瘦，時有寒戰(zhàn)，反應減弱，皮膚暗紅無光澤，耳、爪、尾部等出現(xiàn)瘀點瘀斑，背部青筋顯露，唇周暗紅，舌色紫黯等表現(xiàn)，以及體

9、重增長緩慢，攝食量、飲水量減少，尾出血時間和凝血時間（玻管法）顯著縮短等癥狀體征和實驗室指標的變化，符合血瘀證動物模型的特征性表現(xiàn);痰證組裸小鼠出現(xiàn)了肥胖、行動遲緩、嗜臥少動、喜扎堆、大便黏膩不成形等表現(xiàn)，以及體重增長加快，攝食量、飲水量減少，血脂顯著升高等癥狀體征和實驗室指標的變化，符合痰證動物模型的特征性表現(xiàn);痰瘀互結(jié)證組裸小鼠出現(xiàn)了形體稍胖，嗜臥少動，行動遲緩，蜷臥喜扎堆，皮膚暗紅色，耳、爪、尾部出現(xiàn)瘀點瘀斑，背部青筋顯露，唇周暗

10、紅，舌色紫黯，大便黏膩不成形等表現(xiàn)，以及體重增長緩慢，攝食量、飲水量顯著減少，尾出血時間和凝血時間（玻管法）顯著縮短，血脂顯著升高等癥狀體征和實驗室指標的變化，符合痰瘀互結(jié)證動物模型的特征性表現(xiàn)。
　　(2)將喉鱗癌細胞接種到四組裸鼠腋窩部皮下后成功成瘤。觀察各組裸鼠的在體瘤生長情況，血瘀證組裸鼠腫瘤生長速度較對照組加快，時間點出現(xiàn)在腫瘤接種后第20天（約第3周），痰證組、痰瘀互結(jié)證組裸鼠腫瘤生長速度與對照組比較無顯著差異。腫瘤接

11、種后第28天，三個模型組裸鼠的喉癌體積、喉癌重量與對照組比較，無顯著差異(P＞0.05)。
　　(3)通過MTT實驗檢測不同模型組裸鼠在體喉癌細胞的活性，血瘀證組、痰證組、痰瘀互結(jié)證組裸鼠在體喉癌細胞活性均高于對照組（P＜0.05）。
　　(4)高通量法測序結(jié)果:血瘀證組、痰證組、痰瘀互結(jié)證組喉癌裸鼠的喉癌細胞中均出現(xiàn)miRNA異常表達。血瘀證組、痰瘀互結(jié)證組與對照組比較，血瘀證組、痰瘀互結(jié)證組與痰證組比較，均有大量miRN

12、A表達上調(diào)或下調(diào);而痰證組與對照組比較、血瘀證組與痰瘀互結(jié)證組比較，miRNA表達上調(diào)或下調(diào)數(shù)量相對較少。經(jīng)去重復、文獻回顧篩選后初步確定10個miRNA為血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證影響喉癌裸鼠喉癌細胞miRNA異常表達的目的基因，經(jīng)PCR檢測證實有5個miRNA在模型組裸鼠喉癌細胞中出現(xiàn)顯著異常表達，分別為miR-27a-5p、miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p。血瘀證組、痰瘀互結(jié)證組與

13、對照組比較異常表達的miRNA相同:miR-27a-5p呈高表達;miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p呈低表達。痰證組與對照組比較:miR-27a-5p呈高表達，miR-708-5p呈低表達。
　　結(jié)論:
　　1.臨床研究
　　喉癌患者中醫(yī)體質(zhì)類型以瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)為主，兼有較多虛性體質(zhì)，據(jù)此推測喉癌的發(fā)生可能與瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)、虛性體質(zhì)有關(guān)。
　　2.實驗研究

14、　　血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證可使喉癌細胞活性增強、促進喉癌細胞增殖;在體外成瘤實驗中，血瘀證對喉癌細胞增殖促進作用更為顯著;血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證促進喉癌細胞增殖的基因?qū)W機制可能是通過使喉癌細胞中的miRNA發(fā)生異常表達實現(xiàn)的:血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證可使miR-27a-5p表達上調(diào)，從而促進喉癌細胞增殖，推測miR-27a-5p可能為促進喉癌細胞增殖的基因;血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證可使miR-708-5p表達下調(diào)，血瘀證、痰瘀互結(jié)證

15、可使miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p表達下調(diào)，從而使喉癌細胞的增殖失去抑制作用，促進喉癌的發(fā)展，推測miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p可能為抑制喉癌細胞增殖的基因。
　　3.展望
　　調(diào)整體質(zhì)偏頗，改善瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)、虛性體質(zhì)對預防喉癌有著重要的意義。在喉癌的治療中，對血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證的喉癌可有望通過“化痰祛瘀”法治療，以抑制喉癌細胞的增