二甲雙胍對(duì)雌鼠性早熟伴胰島素抵抗與脂肪芳香化酶作用的研究.pdf

1、目的：
　　1.建立性早熟伴胰島素抵抗雌鼠模型，測(cè)定雌二醇水平及其脂肪組織中芳香化酶表達(dá)、mRNA轉(zhuǎn)錄水平，應(yīng)用二甲雙胍進(jìn)行藥物干預(yù)后測(cè)定雌激素水平及脂肪組織芳香化酶表達(dá)變化，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。探討二甲雙胍在改善糖代謝、脂代謝及胰島素抵抗的同時(shí)，對(duì)雌激素水平及脂肪組織芳香化酶表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用二甲雙胍治療胰島素抵抗的同時(shí)改善女童性早熟提供更多理論依據(jù)。
　　2.應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立3T3-L1胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型，以

2、不同濃度二甲雙胍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，并以丙酸睪酮作為催化反應(yīng)底物，觀察脂肪細(xì)胞在胰島素抵抗情況下芳香化酶表達(dá)及其活性，同時(shí)觀察二甲雙胍干預(yù)對(duì)芳香化酶表達(dá)的影響是否與MEK/ERK信號(hào)通路有關(guān)，并進(jìn)一步討論其干預(yù)的分子水平機(jī)制。
　　方法：
　　1.正常斷乳（21天）SD雌性幼鼠45只，隨機(jī)分為普通飲食組（NC組10只）和高脂飲食組（FC組35只），每日觀察雌鼠陰門(mén)開(kāi)啟情況并記錄陰門(mén)開(kāi)啟日齡。對(duì)比 NC組陰門(mén)開(kāi)啟日齡，將 FC組分為

3、陰門(mén)早開(kāi)組即性早熟組（FC-P組），對(duì)其進(jìn)行稱(chēng)重、取血測(cè)雌二醇及空腹胰島素水平，行OGTT并測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)血糖，結(jié)果顯示存在胰島素抵抗，證明性早熟伴胰島素抵抗雌鼠造模成功，并將其隨機(jī)分為模型組（IR組）、低劑量治療組（IR-L組）和高劑量治療組（IR-H組）。治療組分別給予不同劑量二甲雙胍（Metformin, Met）灌胃治療6周。測(cè)量給藥前后大鼠的體重，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取血檢測(cè)各組大鼠的空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、雌二醇

4、（E2）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL），計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島抵抗指數(shù)（HOMA-IR）；處死各組大鼠并取腎周及卵巢周?chē)具M(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算脂體比；應(yīng)用蛋白免疫印跡法（western blot）及實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）檢測(cè)脂肪組織中芳香化酶的表達(dá)及其mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　2.應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化。參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)前脂肪細(xì)胞的分化方法，對(duì)細(xì)胞

5、進(jìn)行誘導(dǎo)分化：將培養(yǎng)狀態(tài)良好的3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，加入含地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）的培養(yǎng)液進(jìn)行逐步誘導(dǎo)分化，至第9天90％以上的細(xì)胞呈成熟脂肪細(xì)胞表型，可用于后續(xù)試驗(yàn)。細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)明顯脂滴，采用油紅 O染色法進(jìn)行成熟脂肪細(xì)胞鑒定。胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立：對(duì)已經(jīng)誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞進(jìn)行分組處理，采用高糖/高胰島素處理脂肪細(xì)胞，測(cè)定培養(yǎng)液上清中葡萄糖含量并計(jì)算其消耗量，以葡萄糖

6、消耗量及消耗率反映脂肪細(xì)胞胰島素抵抗程度。在成功建立胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，觀察細(xì)胞中芳香化酶表達(dá)、基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，以及不同濃度二甲雙胍對(duì)其影響：設(shè)空白對(duì)照組、胰島素抵抗模型組、不同濃度二甲雙胍干預(yù)組（10-5、10-4、10-3mol/L）。藥物處理48h后應(yīng)用western blot及RT-PCR方法檢測(cè)各組脂肪細(xì)胞中芳香化酶的表達(dá)及其mRNA轉(zhuǎn)錄水平；同時(shí)應(yīng)用酶聯(lián)免疫方法，以丙酸睪酮為底物，測(cè)定各組培養(yǎng)液中雌二醇濃度，以

7、了解各組細(xì)胞中芳香化酶催化活性。在胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型+10-3mol/L二甲雙胍組中加入MEK抑制劑（PD98059），觀察加入PD98059后芳香化酶表達(dá)、mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.高脂飼料喂養(yǎng)的雌鼠可出現(xiàn)性早熟、肥胖，表現(xiàn)為陰門(mén)開(kāi)啟時(shí)間提前、體重及體內(nèi)雌激素水平升高（P<0.05）；并同時(shí)伴有胰島素抵抗。二甲雙胍可降低胰島素抵抗雌鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量及脂體比（P<0.05）。二甲雙胍在調(diào)節(jié)糖、脂代謝

8、的同時(shí)改善胰島素抵抗、降低雌鼠體內(nèi)雌激素水平（P<0.05）；且二甲雙胍呈劑量依賴(lài)性下調(diào)糖代謝指標(biāo)及雌激素水平。性早熟伴胰島素抵抗雌鼠脂肪組織芳香化酶表達(dá)及基因轉(zhuǎn)錄水平均較正常飲食雌鼠升高，二甲雙胍呈劑量依賴(lài)性下調(diào)性早熟伴胰島素抵抗雌鼠脂肪組織芳香化酶表達(dá)及其基因轉(zhuǎn)錄水平（P<0.05）。
　　2.采用高糖/高胰島素培養(yǎng)方法，可將誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞建立為胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型。胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中芳香化酶表達(dá)量升高

9、，二甲雙胍呈劑量依賴(lài)性下調(diào)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中芳香化酶的表達(dá)及雌激素的產(chǎn)生（P<0.05）。加入 MEK抑制劑后，二甲雙胍下調(diào)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞芳香化酶的作用減弱。
　　結(jié)論：
　　1.高脂飼料喂養(yǎng)的雌鼠可出現(xiàn)性早熟、肥胖及胰島素抵抗。
　　2.二甲雙胍在調(diào)節(jié)性早熟伴胰島素抵抗雌鼠糖、脂代謝的同時(shí)，改善其胰島素抵抗。
　　3.胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下雌二醇水平升高，脂肪組織及脂肪細(xì)胞芳香化酶表達(dá)水平升高。
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