二甲雙胍對(duì)CDC的影響在心梗保護(hù)中的作用.pdf

1、背景：心血管疾病已經(jīng)成為當(dāng)今世界對(duì)人類健康危害最嚴(yán)重的一類疾病，而隨著人們物質(zhì)生活水平的不斷提高、人口老齡化的不斷發(fā)展，心血管疾病的患病率仍會(huì)呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢(shì)。作為心血管疾病的典型代表，急性心肌梗塞或心肌梗死(myocardialinfarction，MI)具有較高的死亡率和發(fā)病率，是全球范圍內(nèi)重大的健康問(wèn)題之一。依據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)的數(shù)據(jù)，心肌梗死占到目前全球死亡的30％，同時(shí)

2、預(yù)計(jì)到2030年每年至少有2300萬(wàn)人死于該病發(fā)作，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。其中心肌細(xì)胞受損和缺血是心肌梗死中最常見(jiàn)的病理改變，而成年心肌細(xì)胞作為一種高度分化的終末細(xì)胞，一般認(rèn)為其不能再生。目前，對(duì)于急性心肌梗死的病人，我們通常會(huì)及時(shí)的應(yīng)用藥物治療以及PCI等手段進(jìn)行治療，旨在及早高效的恢復(fù)心梗后缺血心肌血液供應(yīng)，阻止心肌缺血性損傷的進(jìn)一步發(fā)展、加重，減少心肌梗死面積，從而最終改善心肌梗死臨床預(yù)后。盡管當(dāng)前我們對(duì)于心肌梗死的治療取得了

3、長(zhǎng)足的進(jìn)步，但仍無(wú)法從根本上逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)以及后續(xù)的心功能不全與心力衰竭，這也就意味著我們的治療手段僅能控制、減小心肌梗死所帶來(lái)的不良預(yù)后，而不能從根本上達(dá)到“救治”已經(jīng)受損的心肌細(xì)胞甚至“治愈”的效果。
　　當(dāng)前，利用干細(xì)胞治療心肌梗死的研究已成為心血管疾病的一個(gè)重要研究領(lǐng)域，并得到廣泛的關(guān)注和研究，已有多種干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室或臨床應(yīng)用于心肌梗死的干細(xì)胞治療中，主要包括骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞及胚胎干細(xì)

4、胞等，雖然取得了一定的治療效果，但這種效果是不穩(wěn)定且不顯著的，同時(shí)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞治療還面臨著致瘤性和倫理學(xué)問(wèn)題。心肌球源性干細(xì)胞(cardiosphere-derived cells，CDC)是由心臟組織塊培養(yǎng)而來(lái)，表達(dá)c-kit及Islet-1心肌組細(xì)胞以及眾多周?chē)С旨?xì)胞共同組成的心臟源性細(xì)胞亞群，可穩(wěn)定傳代的干細(xì)胞。一項(xiàng)最新的CADUCEUS臨床研究表明，經(jīng)冠脈移植自源性心肌球源性干細(xì)胞治療的患者在一年后，相較于一般

5、患者瘢痕組織減少，有效心肌數(shù)量增加，心功能得到改善，且并沒(méi)有其他安全風(fēng)險(xiǎn)，因此，心肌球源性干細(xì)胞是當(dāng)前最有前景的移植治療心肌梗死的干細(xì)胞類型之一。
　　盡管心肌球源性干細(xì)胞移植治療在動(dòng)物和患者身上都能保護(hù)并改善心梗后的受損心肌，當(dāng)它和其他干細(xì)胞治療方案一樣仍面臨著移植后宿主心臟惡劣微環(huán)境所導(dǎo)致的低存活率的瓶頸，這些惡劣的微環(huán)境包括較高的炎癥因子和大量的氧自由基。當(dāng)前已有多項(xiàng)在動(dòng)物身上的研究應(yīng)用遺傳基因改良的操作，向干細(xì)胞中引入改善

6、移植后存活的相關(guān)基因以期解決這一難題，例如PHD2、AKT、Bcl-2，SDF-1以及趨化因子受體1等。雖然這些研究取得了一定成果，但離實(shí)際的臨床應(yīng)用還有一定的距離。當(dāng)然，如果能找到一種臨床上已知且能夠有效地提高干細(xì)胞移植后的存活率的藥物，從而提高干細(xì)胞治療的效果，將十分鼓舞人心。
　　在近年多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍（metformin，MET），作為治療2型糖尿病的一線臨床藥物，可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activate

7、d protein kinase，AMPK)。AMPK是一種蛋白激酶，它能夠促進(jìn)脂肪酸氧化，促進(jìn)葡萄糖運(yùn)輸，加速糖酵解，抑制體內(nèi)甘油三酯和蛋白質(zhì)合成，與此同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)表明激活A(yù)MPK可通過(guò)保護(hù)線粒體凋亡的機(jī)制促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活。令人驚喜的是，一項(xiàng)在狗身上進(jìn)行的研究證實(shí)了二甲雙胍能夠通過(guò)AMPK依賴的途徑減少氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，從而表明二甲雙胍具有潛在的獨(dú)立于降糖作用之外的心臟保護(hù)作用，進(jìn)而具有減輕缺血再灌注引起的損傷的效果。

8、AMPK是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子，對(duì)于干細(xì)胞的存活亦有重要作用。在一項(xiàng)關(guān)于胚胎干細(xì)胞的研究中，eNOS的過(guò)表達(dá)幫助干細(xì)胞維持低含量的NO，從而減少胚胎干細(xì)胞的凋亡。心肌球源性干細(xì)胞是有離體心臟組織在體外分離、培養(yǎng)獲得的，與心臟細(xì)胞有同源性，同時(shí)，eNOS是一種潛在的獨(dú)立細(xì)胞保護(hù)信號(hào)分子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及不同類型的干細(xì)胞中有所表達(dá)，CDCs中eNOS也有表達(dá)?？紤]到心肌球源性干細(xì)胞和心肌組織的同源性，我們提出如下科學(xué)問(wèn)

9、題:二甲雙胍能否拮抗超氧應(yīng)激對(duì)CDCs的損傷作用、提高其存活率，進(jìn)而增強(qiáng)CDC移植治療心肌梗死的效果？這種保護(hù)作用是通過(guò)激活A(yù)MPK/eNOS信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)的嗎？
　　二甲雙胍這種抗氧化應(yīng)激功能對(duì)于心肌球源性干細(xì)胞是否有類似的保護(hù)作用，二甲雙胍能否實(shí)質(zhì)性的提高心肌球源性干細(xì)胞移植后的在體存活率，以及二甲雙胍的引入能否有效提高心肌球源性干細(xì)胞移植治療心肌梗死的治療效果，本研究期待探討這些問(wèn)題的答案。
　　內(nèi)容和方法：
　

10、　1、分離提取心肌球源性干細(xì)胞:將已有的GFP轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的C57小鼠的心臟組織迅速剪取離體，切成體積小于小鼠的心臟組織被切成體積小于1mm3的碎片，經(jīng)胰島素部分酶解后，將這些組織碎片移植在含有2毫升CEM，被纖連蛋白覆蓋的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培育。經(jīng)歷足夠的增長(zhǎng)周期（約1周）之后，用溫和的酶消化、收獲包裹心臟組織塊周?chē)缮⒌?、呈階段性擴(kuò)散增殖的貼壁類基質(zhì)細(xì)胞，以1×105 cells/ml的密度被接種在由多聚賴氨酸覆蓋的含CGM培養(yǎng)皿中。收集培

11、育而來(lái)的自由懸浮的心肌球(cardiospheres)，轉(zhuǎn)入普通培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，得到心肌球源性干細(xì)胞。建立體外心肌球源性干細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型:將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的心肌球源性干細(xì)胞在不含血清的介質(zhì)中培育24小時(shí)，之后在含有30μmol/L雙氧水的培養(yǎng)基中繼續(xù)培育24小時(shí)以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。建立小鼠心梗模型:選用4個(gè)月左右年齡的成年雄性C57小鼠構(gòu)建小鼠MI模型進(jìn)行研究。在異氟烷吸入麻醉的狀況下，對(duì)小鼠進(jìn)行左前降支(LAD)冠狀動(dòng)脈的永久結(jié)扎，

12、LAD動(dòng)脈在直視下用7-0絲綢縫合線進(jìn)行永久結(jié)扎。對(duì)于對(duì)照組小鼠，除了永久結(jié)扎LAD部分，對(duì)其實(shí)施了相同的外科手術(shù)方法。建立大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型:對(duì)大鼠進(jìn)行左前降支（LAD）冠狀動(dòng)脈的臨時(shí)結(jié)扎，30分鐘后解除結(jié)扎并誘導(dǎo)再灌注。
　　2、為了明確在體外氧化應(yīng)激損傷模型中二甲雙胍能否提高心肌源性干細(xì)胞的存活率，我們?cè)跇?gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型前，對(duì)心肌球源性干細(xì)胞用MET以不同的劑量(1、10、100、1000、3000、5000μ

13、mol/L)，以不同的處理時(shí)長(zhǎng)(15、30、60、120、180分鐘)進(jìn)行預(yù)處理，以期減少H2O2誘導(dǎo)的心肌球源性干細(xì)胞細(xì)胞凋亡。
　　3、為了明確及量化移植后在體心肌球源性干細(xì)胞的存活率，在GFP-CDC移植手術(shù)之后，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)以酶消化的方法將取出的小鼠心臟酶解，分離成單個(gè)的心臟來(lái)源的細(xì)胞。其中GFP陽(yáng)性的細(xì)胞即代表了心肌球源性干細(xì)胞和它們的派生細(xì)胞，我們對(duì)其進(jìn)行仔細(xì)計(jì)數(shù)，最后我們得到移植后在體心肌球源性干細(xì)胞的存活率:10

14、0％×（存活的GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量/1×105）。為了觀察心臟在體的GFP陽(yáng)性心肌球源性干細(xì)胞的存活率，用GFP抗體、a-actinin抗體和DAPI對(duì)心臟組織進(jìn)行染色觀察。
　　4、為了明確二甲雙胍對(duì)心肌球源性干細(xì)胞的保護(hù)作用能否應(yīng)用于改良此種干細(xì)胞對(duì)心肌梗死的治療，小鼠心梗模型的基礎(chǔ)上，術(shù)后在梗死邊緣區(qū)四點(diǎn)分別進(jìn)行一次心肌內(nèi)注射，根據(jù)注射內(nèi)容的不同分為PBS+MI組、MET+MI組、CDC+MI組和MET+CDC+MI組。在小鼠

15、接受手術(shù)后的第2、4周，以雙盲法的形式用超聲波心動(dòng)描記術(shù)來(lái)評(píng)估清醒小鼠的心肌結(jié)構(gòu)和功能，包括左心室射血分?jǐn)?shù)EF、左心室短軸縮短率FS及左心室舒張內(nèi)徑LVIDd。同時(shí)通過(guò)masson染色的組織學(xué)方法對(duì)小鼠心肌梗死面積和心肌各部位纖維化程度進(jìn)行形態(tài)定量分析。
　　5、進(jìn)一步明確二甲雙胍對(duì)心肌球源性干細(xì)胞的保護(hù)作用并探討其相關(guān)機(jī)制。對(duì)心肌球源性干細(xì)胞進(jìn)行不同的處理，加入適宜劑量的MET，加入AICAR以激活A(yù)MPK，加入Compound

16、-C以阻止AMPK。對(duì)接受不同方法處理后的CDC細(xì)胞，用CCK8檢測(cè)處理后各組細(xì)胞活性;進(jìn)行AnnexinV及PI共染色，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，觀察經(jīng)不同處理后心肌球源性干細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的比率;通過(guò)Tunel染色檢測(cè)接受不同方法處理后的心肌球源性干細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的比率。
　　6、為了進(jìn)一步探討二甲雙胍保護(hù)心肌球源性干細(xì)胞的具體機(jī)制，我們還通過(guò)免疫印跡的方法對(duì)AMPK（二甲雙胍發(fā)揮抗氧化應(yīng)激功能的關(guān)鍵因子）及其磷酸化水平、eNOS及

17、其磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1、在心肌梗死的動(dòng)物模型和體外氧化應(yīng)激損傷模型都發(fā)現(xiàn)，MET可有效保護(hù)心肌球源性干細(xì)胞的存活。體外實(shí)驗(yàn)證明，二甲雙胍對(duì)心肌球源性干細(xì)胞的這種保護(hù)作用呈時(shí)間、濃度依賴型關(guān)系，我們通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)最終確定了MET保護(hù)心肌球源性干細(xì)胞的最適作用時(shí)間及濃度(60min，100μmol/L)。
　　2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，單純的心肌球源性干細(xì)胞移植可提高小鼠心肌梗死后心功能、減小梗死面積及纖維化程

18、度，但改善程度有限。經(jīng)過(guò)二甲雙胍的預(yù)處理，聯(lián)合心肌球源性干細(xì)胞移植和二甲雙胍治療的方案可進(jìn)一步改善小鼠心肌梗死的預(yù)后。
　　3、二甲雙胍主要通過(guò)發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激作用來(lái)提高心肌球源性干細(xì)胞存活率，這種保護(hù)作用依賴于AMPK介導(dǎo)的分子途徑。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，引入AMPK激動(dòng)劑AICAR和AMPK抑制劑Compound C替代實(shí)驗(yàn)組中的MET，從陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照兩方面進(jìn)一步觀察AMPK信號(hào)途徑對(duì)心肌球源性干細(xì)胞存活率及凋亡情況的影響。結(jié)果

19、發(fā)現(xiàn)MET和AICAR都可以提高氧化應(yīng)激條件下心肌球源性干細(xì)胞的存活率，使心肌球源性干細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞減少，使AnnexinV染色陽(yáng)性比率細(xì)胞減少，而CompoundC則可以抵消這些改善作用。結(jié)果表明MET是通過(guò)激活A(yù)MPK對(duì)心肌球源性干細(xì)胞發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的。
　　4、AMPK是一種蛋白激酶，其下游還有很多效應(yīng)分子。作為潛在的細(xì)胞保護(hù)信號(hào)分子，eNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及不同種類的干細(xì)胞中都有表達(dá)。在心肌球源性干