二甲雙胍和胰島素對(duì)胰腺癌細(xì)胞microRNAs的影響及相關(guān)研究.pdf

1、目的：①研究二甲雙胍和胰島素或其類似物對(duì)人胰腺癌細(xì)胞miRNAs表達(dá)的影響。②體外實(shí)驗(yàn)研究明顯差異表達(dá)的miRNA對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。③預(yù)測(cè)并驗(yàn)證明顯差異表達(dá)miRNA的靶基因。④動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究二甲雙胍和胰島素或其類似物對(duì)胰腺癌裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響,及穩(wěn)定上調(diào)明顯差異表達(dá)的miRNA對(duì)裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生長(zhǎng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法：①采用Exiqon miRCURYTM LNA miRNA定

2、量PCR芯片檢測(cè)一定濃度二甲雙胍或甘精胰島素對(duì)人胰腺癌Sw1990細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響,并在不同的胰腺癌細(xì)胞、不同類型胰島素、不同藥物濃度和不同作用時(shí)間的條件下,采用Stem-loop定量PCR方法驗(yàn)證芯片結(jié)果。②選定差異表達(dá)最明顯的miRNA,采用siRNA干擾技術(shù)明顯上調(diào)或下調(diào)該miRNA,檢測(cè)其對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響:CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖;Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲、遷移;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。③根據(jù)多個(gè)

3、權(quán)威預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)該miRNA的靶基因,采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、定量PCR及Westemblot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。④構(gòu)建Sw1990細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型,檢測(cè)二甲雙胍和甘精胰島素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)影響;構(gòu)建該miRNA的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染Sw1990細(xì)胞后篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染該miRNA細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤和尾靜脈轉(zhuǎn)移瘤模型,檢測(cè)該miRNA在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果：①miRNA定量PCR芯片結(jié)果表明二甲雙胍可上調(diào)

4、Sw1990細(xì)胞中9種miRNA的表達(dá)(≥2倍),miR-26a、miR-192和let-7c為上調(diào)最明顯的三個(gè)miRNA;甘精胰島素可上調(diào)Sw1990細(xì)胞中10個(gè)miRNA的表達(dá)(≥2倍),下調(diào)2個(gè)miRNA的表達(dá)(≥2倍),miR-95、miR-134和miR-34c-3p為調(diào)節(jié)最明顯的三個(gè)miRNA。Stem-loop定量PCR表明在Sw1990和Panc-1細(xì)胞中,二甲雙胍可以劑量依賴的形式上調(diào)miR-26a、miR-192和l

5、et-7c的表達(dá),但未見(jiàn)明顯的時(shí)間依賴關(guān)系;甘精胰島素和地特胰島素明顯上調(diào)了miR-95和miR-134的表達(dá),但對(duì)miR-34c-3p的表達(dá)無(wú)顯著影響,其中miR-134的表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系;普通胰島素和賴脯胰島素未明顯改變兩種胰腺癌細(xì)胞中miR-95、miR-134和miR-34c-3p的表達(dá)。②瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a可促進(jìn)Sw1990和Pane-1細(xì)胞的凋亡,抑制其增殖、侵襲和遷移能力;轉(zhuǎn)染miRNA-26a抑制劑則可獲得相反的

6、效果。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-95可減少Sw1990和Panc-1細(xì)胞的凋亡,增強(qiáng)其增殖、侵襲和遷移能力;轉(zhuǎn)染miR-95抑制劑可獲得相反的效果。⑨雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、Western blot及定量PCR表明高遷移率族蛋白A1(HMGA1)為miR-26a的直接靶基因。④二甲雙胍可抑制Sw1990裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng),而甘精胰島素對(duì)裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-95的Sw1990細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤和尾靜脈轉(zhuǎn)

7、移模型,miR-26a可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,miR-95則可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：①二甲雙胍可顯著增高胰腺癌Sw1990和Panc-1細(xì)胞中miR-26a的表達(dá),而甘精胰島素和地特胰島素則顯著增高了Sw1990和Panc-1細(xì)胞中miR-95的表達(dá)。②體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明miR-26a可抑制胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移,而miR-95則可促進(jìn)胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。胰腺癌細(xì)胞miRNA的相關(guān)變化可能是二甲雙胍、甘精胰島素和地特胰島