二甲雙胍通過PI3K-AKT通路影響多囊卵巢綜合征大鼠胰島素抵抗的研究.pdf

1、研究目的:
　　多囊卵巢綜合征（PCOS）是生育年齡女性最常見的內(nèi)分泌異常和代謝障礙性疾病，發(fā)病率占全球育齡女性5％~10%。持續(xù)性無排卵，雄激素過多和胰島素抵抗(IR)是其重要特征。IR在PCOS發(fā)病機制中起著重要的作用，50-70%患者存在不同程度的IR，但其機制尚未清楚。本實驗旨在通過高脂飲食加來曲唑構(gòu)建SD雌性大鼠多囊卵巢綜合征-胰島素抵抗（PCOS-IR）動物模型，分析PI3K/AKT信號通路與PCOS-IR的關(guān)系，研究

2、二甲雙胍對PCOS-IR大鼠的卵巢和肝臟組織中PI3K、AKT基因和蛋白的水平變化，探討PI3K/AKT信號通路在二甲雙胍影響多囊卵巢綜合征大鼠胰島素抵抗的分子機制及意義，從而指導(dǎo)PCOS的臨床治療。
　　研究方法：
　　1.實驗動物及分組
　　1.1.實驗動物：選取6周齡（185±10g）健康雌性Spragu Dawley（SD）雌性大鼠32只。購自廣東省動物中心。
　　1.2.隨機分組：正常對照組8只，模型組

3、8只，二甲雙胍組8只，二甲雙胍+阻斷劑組8只。
　　2.實驗方法
　　2.1.PCOS-IR模型建立：采用髙脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合來曲唑構(gòu)建SD雌性大鼠PCOS-IR模型，模型組給予來曲唑（1mg/kg/d）刺激并喂以高脂飼料,正常組給予雙蒸水并喂以普通飼料，連續(xù)30天。將大鼠分為四組，二甲雙胍組大鼠用二甲雙胍(300mg/kg/d)灌胃干預(yù)，二甲雙胍+阻斷劑組采用二甲雙胍灌胃+LY294002尾靜脈注射干預(yù)，正常組和模型組灌予等容

4、量雙蒸水。
　　2.2.通過大鼠陰道細胞涂片觀察動情周期；測大鼠總體重和雙側(cè)卵巢重量。
　　2.3.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測四組大鼠外周血清睪酮（T）、雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、LH/FSH；代謝指標空腹胰島素(FINS)，空腹血糖(FBG)；計算穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。
　　2.4.HE染色方法觀察四組PCOS大鼠卵巢病理組織結(jié)構(gòu)變化。2.5腹腔注射葡萄糖

5、實驗評估胰島素抵抗。
　　2.5.采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測四組卵巢和肝臟組織PI3K mRNA、AKT mRNA的表達量。
　　2.6.采用Western-Blot方法檢測四組卵巢和肝臟組織中p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.模型構(gòu)建：模型組大鼠總體重、卵巢重量顯著高于正常組（320.51±19.08 vs246.60±10.21、88.44±7.01vs66

6、.87±7.53，P＜0.01）。模型組大鼠血清T（4.07±3.41 vs0.65±0.14）、LH（12.88±14.0 vs0.88±0.35）、LH/FSH（5.45±6.01vs0.19±0.09）比正常組顯著升高，P＜0.01,血清FSH水平較正常組降低（2.53±1.25 vs5.46±2.65，P＜0.05)。模型組血清E2水平較之對照組略升高,但差異無統(tǒng)計學意義。卵巢組織病理切片顯示：模型組卵巢有較多的囊狀擴張卵泡及閉

7、鎖卵泡，卵泡及黃體數(shù)目明顯減少，顆粒細胞數(shù)減少。正常組可見不同發(fā)育階段的卵泡及多個黃體，顆粒細胞層數(shù)多。模型組大鼠空腹血糖、胰島素和HOMA-IR與正常相比明顯增高（6.84±0.17 vs4.69±0.36，P＜0.01；37.93±4.06 vs19.58±2.19，P＜0.05；11.45±1.83 vs4.04±0.48，P＜0.05）。兩組血糖均在糖負荷15min后達到峰值,且模型組在糖負荷120min后血糖值仍無明顯回落,顯

8、著高于正常組（8.18±2.23mmol/Lvs5.14±0.43mmol/L,P〈0.05）。模型組大鼠葡萄糖曲線下面積（AUCglu）明顯比正常組大（24.37±0.66mmol/Lvs12.94±1.39mmol/L，P＜0.05)。
　　2.建模成功后，與模型組比，給予二甲雙胍治療后顯發(fā)現(xiàn)示大鼠外周血血清性激素T、LH和FBG、FINS等代謝指標顯著降低，而給予PI3K/AKT通路阻斷劑-LY294002干預(yù)后發(fā)現(xiàn)可阻斷二

9、甲雙胍對PCOS的生殖激素紊亂和IR的改善。通過檢測大鼠PI3K和AKT的基因和蛋白表達量發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝臟和卵巢組織PI3KmRNA表達量顯著低于正常組（0.59±0.09 vs1.03±0.21；0.44±0.07 vs1.01±0.17，P＜0.05）。AKT mRNA表達量趨勢同上（0.57±0.20vs1.01±0.13；0.57±0.13 vs1.01±0.26，P＜0.05）。給予二甲雙胍后，與模型組相比，大鼠肝臟和卵巢

10、組織PI3K和AKTmRNA明顯上升，分別是（0.92±0.23 vs0.59±0.09；0.82±0.13vs0.44±0.07，P＜0.05）和（0.74±0.10vs0.57±0.20,P＜0.01；0.81±0.34 vs0.57±0.13，P＜0.01）。阻斷劑LY294002干預(yù)后，可阻斷肝臟和卵巢組織PI3K和AKTmRNA的表達。大鼠肝臟和卵巢PI3K和AKT的蛋白表達量與其基因變化趨勢一樣。
　　結(jié)論: