胃癌相關(guān)microRNAs的篩選及其對胃癌的早期診斷作用.pdf

1、胃癌（GC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率占全球癌癥發(fā)病率的第5位，死亡率則位居2位。胃癌也是我國最常見的惡性腫瘤之一，分別占男女性癌癥發(fā)病率的第2位和第3位，死亡率均位于第2位。胃癌的早期診斷與治療對于改善患者預(yù)后具有重要作用，但我國早期胃癌的診斷率不足10％，半數(shù)以上的病例發(fā)現(xiàn)時已處于Ⅲ、Ⅳ期，出現(xiàn)了局部大血管侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即使給予姑息手術(shù)聯(lián)合放化療治療，其遠(yuǎn)期預(yù)后也較差，5年生存率不足30%。現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)記物在早期胃癌中變化

2、不明顯，僅在部分進(jìn)展期胃癌中升高，因此迫切需要一種新的胃癌相關(guān)生物學(xué)標(biāo)記物，為胃癌的早期診斷和治療提供指導(dǎo)。microRNAs（miRNAs）的發(fā)現(xiàn)為胃癌的早期診斷提供了新的方向。miRNAs是一類長度在22 nt左右的內(nèi)源性非編碼小RNA，主要通過與Argonaute家族蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC），在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)。大量研究顯示，miRNAs在調(diào)控癌細(xì)胞的生長、增殖、分化及凋亡中均發(fā)揮著重要作用，并與

3、癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程相關(guān)。此外，研究顯示，在血漿中可檢測到穩(wěn)定表達(dá)的miRNAs，這些都為miRNAs應(yīng)用于胃癌的早期診斷提供了理論基礎(chǔ)。
　　目的：篩選胃癌血漿和組織中差異表達(dá)的miRNAs，評價其作為生物學(xué)標(biāo)記物對胃癌的診斷價值。
　　方法：收集42例胃癌患者血漿標(biāo)本、42例年齡和性別匹配的正常對照者血漿標(biāo)本，23對福爾馬林固定、石蠟包埋的胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本。應(yīng)用solexa測序，在8對胃癌血漿和正常血漿，8對胃癌

4、組織和癌旁組織中初步篩選胃癌差異表達(dá)的 miRNAs。在復(fù)篩階段，應(yīng)用 qRT-PCR逐步擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA。然后，應(yīng)用ROC曲線分析篩選出的 miRNAs對胃癌的診斷價值。最后，對胃癌細(xì)胞培養(yǎng)基中的miRNAs表達(dá)水平進(jìn)行研究，分析血漿中miRNAs的可能來源。
　　結(jié)果：⑴胃癌血漿中檢測到635種 miRNAs的表達(dá)，健康對照血漿中檢測到634種miRNAs，胃癌組織中檢測到1023種miRNAs，癌旁組織

5、中檢測到772種miRNAs。其中，血漿中差異表達(dá)的miRNAs有146種，組織中差異表達(dá)的miRNAs有207種，在血漿和組織中表達(dá)一致的miRNAs共有31種。⑵應(yīng)用qRT-PCR，在測序標(biāo)本（8對胃癌血漿和正常血漿，8對胃癌組織和癌旁組織）中對上一階段篩選出的31種miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行逐一驗(yàn)證，進(jìn)一步篩選差異表達(dá)的 miRNAs。結(jié)果顯示， miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p

6、、miR-654-3p在胃癌血漿及組織中的表達(dá)都是升高的，用于下一步驗(yàn)證。⑶在42例胃癌血漿和42例正常血漿，23對胃癌組織及癌旁組織中，進(jìn)一步驗(yàn)證上階段差異表達(dá)的5種 miRNAs。結(jié)果顯示，miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p在胃癌血漿中的相對表達(dá)量（與U6比較，中位數(shù)）依次為0.0169、0.0231、0.0282、0.0363、0.0058；在健康對照血漿中的

7、相對表達(dá)量依次為：0.0030、0.0101、0.0100、0.0157、0.0032；兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p在胃癌組織中的相對表達(dá)量（與U6比較，中位數(shù)）依次為：14.77、0.63、0.92、0.64、0.16；在癌旁組織中的相對表達(dá)量依次為：7.56、0.36、0.58、0.42、0.07；兩組之間的差異

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p在胃癌血漿及組織的表達(dá)中均明顯升高。⑷為了檢測5種miRNA對胃癌的診斷作用，對42例胃癌血漿患者及42例健康對照進(jìn)行 ROC曲線分析。結(jié)果顯示，單獨(dú)檢測 miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p的曲線下面積分別為：0.785（95%CI

9、：0.688~0.882）、0.766（95%CI：0.663~0.869）、0.743（95%CI：0.634~0.851）、0.729（95%CI：0.620,0.838）和0.724（95%CI：0.614~0.833）。聯(lián)合檢測miR-17-5p和miR-127-3p的曲線下面積可達(dá)0.810（95%CI：0.720~0.901）。以上結(jié)果表明檢測這5種miRNAs有助于胃癌的診斷。⑸為了解目的miRNA的檢測是否有助于早期胃癌

10、的診斷，本研究對健康對照、早期胃癌、進(jìn)展期胃癌血漿中5種miRNA表達(dá)水平進(jìn)行了對比研究。結(jié)果顯示，miR-433-3p、miR-654-3p在早期胃癌中未見明顯變化（P>0.05），僅在進(jìn)展期胃癌中可見明顯升高（ P<0.05）。而 miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p的表達(dá)水平在早期胃癌中即出現(xiàn)了明顯升高（P<0.05），表明這3種miRNAs可能有助于早期胃癌的診斷。⑹在SGC7901胃癌細(xì)胞培養(yǎng)基中，m

11、iR-17-5p的表達(dá)量隨時間延長逐漸升高（P<0.05），而miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p無明顯變化（P>0.05）。結(jié)果提示血漿miR-17-5p水平升高，可能主要來源于胃癌細(xì)胞的分泌。
　　結(jié)論：①miR-17-5p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-433-3p、miR-654-3p在胃癌血漿和組織中表達(dá)升高。②血漿miR-17-5p、miR-127