胃癌血清適配子對胃癌診斷價值的研究.pdf

1、背景與目的:
　　目前胃癌的篩查性診斷主要依賴胃鏡,但是胃鏡為有創(chuàng)性檢查,且費用較高,部分患者因恐懼而不愿接受胃鏡檢查。血清腫瘤標志物檢測是簡便易行的腫瘤篩查診斷方法,但目前仍缺乏有臨床價值的胃癌標志物。適配子是一種生物分子的單鏈核酸配體,通過指數(shù)擴增的配體系統(tǒng)進化(SELEX)技術(shù)從人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫中篩選獲得,能高特異性、高親和力結(jié)合靶分子,用于疾病診斷具有良好的應(yīng)用前景。本課題組在前期研究中,以胃癌血清為靶標進行

2、了10輪適配子篩選,克隆分離出一批適配子,其中部分適配子與胃癌混合血清的結(jié)合程度大于與正常混合血清,但對胃癌診斷價值并不理想。為此,本研究在前期篩選的基礎(chǔ)上繼續(xù)篩選特異性更好的適配子,然后進行基于適配子的胃癌診斷研究,為建立新的胃癌篩查性診斷新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.血清標本收集及混合血清的制備:收集南昌大學第一附屬醫(yī)院2012-2013年間就診的胃癌、非萎縮性胃炎、消化性潰瘍病人和參加體檢且各項檢查均正常的健康

3、人的血清標本,-80℃保存?zhèn)溆?。隨機取胃癌血清標本15例等量混合制備胃癌混合血清,同法制備正?；旌涎濉?br>　　2.胃癌血清適配子的再篩選和分離:以前期第10輪胃癌血清適配子篩選后的亞文庫繼續(xù)進行SELEX篩選,并采用聚丙烯酰胺電泳逐輪監(jiān)測亞文庫條帶的集中度和特異性,并據(jù)此確定篩選終點。選擇與胃癌混合血清有特異性結(jié)合的適配子亞文庫進行對稱PCR擴增,送生物工程公司克隆測序,分離適配子。
　　3.胃癌血清適配子的鑒定:采用RNA

4、Structure4.6軟件模擬分析所分離適配子的二級結(jié)構(gòu)。選出二級結(jié)構(gòu)少且自由能低的適配子進行人工合成,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳及灰度分析法先確定適配子與血清標本作用時兩者的合適用量,再小樣本血清標本鑒定適配子與胃癌血清結(jié)合的特異性,即將適配子分別與胃癌和正常血清標本各16例孵育、聚丙烯酰胺凝膠電泳和GelRed染色,測定游離帶的灰度值,計算其與適配子對照的比值。胃癌組灰度比值小于正常組且差異有統(tǒng)計學意義者為胃癌血清特異性適配子。

5、>　　4.熒光法評價適配子對胃癌的診斷價值:選出對胃癌血清有一定特異性的適配子,采用本課題組建立的熒光法來評價它們對胃癌的診斷價值。在確定適配子及血清的合適用量后,隨機挑選胃癌、正常血清標本各15例,初步篩選對胃癌有診斷價值適配子。選擇組間有差異且診斷胃癌的AUROC在0.9以上的適配子,熒光法小樣本(胃癌、正常血清標本各32例)驗證它們對胃癌的診斷價值。對小樣本驗證有價值的適配子再擴大樣本(胃癌、良性胃病、正常血清各100例左右)確認

6、它們對胃癌的診斷價值。同時以結(jié)合緩沖液代替適配子測定血清標本的本底熒光值。單獨和聯(lián)合分析適配子、血清本底熒光值診斷胃癌的AUROC和效能(敏感度、特異度、準確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比和陰性似然比)。
　　結(jié)果:
　　1.胃癌血清適配子的再篩選和分離:再篩選過程中,電泳顯示亞文庫條帶逐漸集中,與胃癌混合血清結(jié)合的特異性呈不斷增強趨勢,至第18輪時停止篩選。取第14~18輪的亞文庫分別送公司克隆,共分離出160個適

7、配子。
　　2.胃癌血清適配子的鑒定:二級結(jié)構(gòu)模擬分析顯示所分離的適配子有豐富的二級結(jié)構(gòu),其中21個適配子的二級結(jié)構(gòu)多樣性少于2種。小樣本血清標本鑒定顯示,21個適配子中有11個的胃癌組游離條帶灰度比值小于正常組,且組間差異有或接近有統(tǒng)計學意義(P<0.1),即胃癌血清特異性適配子。
　　3.適配子對胃癌的診斷價值:將上述11個胃癌血清特異性適配子分別與胃癌、正常血清標本各15例孵育后測定熒光值,結(jié)果顯示有3個適配子(AP-

8、GCS-15-16、AP-GCS-16-17、AP-GCS-17-16)診斷胃癌的AUROC達到0.9以上。將這3個初篩對胃癌有良好診斷價值的適配子進行小樣本驗證(胃癌、正常血清各32例),結(jié)果顯示適配子AP-GCS-15-16、AP-GCS-17-16診斷胃癌的AUROC均在0.7以上。對這2個適配子擴大樣本(胃癌106例、良性胃病84例、正常血清94例)驗證它們對胃癌的診斷價值,結(jié)果顯示適配子 AP-GCS-15-16的熒光值在胃癌

9、組與良性胃病組和正常組均有統(tǒng)計學差異(P<0.001),而良性胃病組與正常組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),診斷胃癌的AUROC達到“良好”水平(0.880),敏感度為70.8％,特異度為84.9%,準確度為79.6%,但AP-GCS-17-16只有0.656。此外,血清本底熒光對胃癌的診斷價值有限,AUROC只有0.632。
　　4.適配子聯(lián)合分析對胃癌的診斷價值:聯(lián)合分析可提高對胃癌的診斷價值。AP-GCS-15-16與血清本

10、底熒光聯(lián)合檢測診斷胃癌的AUROC從0.880提高至0.920,敏感度為89.6%,特異度為81.5%,確準度為84.5%;AP-GCS-17-16與血清本底熒光聯(lián)合檢測診斷胃癌的AUROC從0.656提升至0.725;AP-GCS-15-16與AP-GCS-17-16聯(lián)合分析診斷胃癌的AUROC為0.885,無明顯提高。
　　結(jié)論:
　　(1)通過 SELEX技術(shù)再篩選,成功獲得一組胃癌血清適配子,其中部分適配子能與胃癌血