蟲媒病毒和呼吸道病毒Array-ELISA檢測方法的建立.pdf

1、背景:蟲媒病毒是一些通過吸血節(jié)肢動物叮咬敏感脊椎動物而引起的自然疫源性疾病及人獸共患病的一群病毒，包括14個病毒科，500多種病毒，其中130余種可引起人、畜疾病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、關節(jié)痛、出血熱和腦炎等。近年來，隨著人類活動范圍擴大和全球氣候變暖，蟲媒病毒疫源地逐漸擴大，人類與媒介的接觸機會增加。在全球范圍內，蟲媒病毒的傳播和流行程度不斷擴大，新發(fā)的蟲媒病毒層出不窮，對人類健康造成巨大的威脅。我國幅員遼闊，自然環(huán)境復雜，蟲媒病毒宿

2、主種類多、分布廣，是多種蟲媒病毒的自然疫源地，蟲媒病毒是我國公共衛(wèi)生安全的重大威脅。呼吸道病毒指主要以呼吸道為侵入門戶，首先在呼吸道粘膜上皮細胞中增殖引起呼吸道以及全身感染，造成呼吸道及其他器官損害的病毒的總稱。呼吸道病毒包括正粘病毒科、副粘病毒科、披膜病毒科、小RNA病毒科、腺病毒科和皰疹病毒科的200余種病毒。呼吸道病毒通過氣溶膠和飛沫形式傳播，傳播能力強，人感染后發(fā)病急，往往導致群體性爆發(fā)，歷史上呼吸道病毒曾多次引起世界大流行，給

3、人類社會帶來了巨大的災難。世界衛(wèi)生組織將呼吸道感染列為全球范圍內導致5歲以下兒童死亡的第二大誘因，臨床上的急性呼吸感染中有90～95％由呼吸道病毒引起。Array-ELISA是華大吉比愛開發(fā)的一種將經典ELISA技術和現(xiàn)代的芯片技術相結合的新技術，具有高特異性、高靈敏度和高通量的特點。Array-ELISA方法將多種抗原或抗體通過非接觸式點樣點制在96孔板的每個微孔中形成陣列，其反應原理和操作步驟與ELISA相同，最后采用電化學發(fā)光和高

4、靈敏的電荷耦合器件感應器結合，將反應信號放大，通過配套軟件讀取反應結果并輸出。Array-ELISA方法中捕獲陣列每點所需的點樣體積30nL，僅為ELISA包被體積的1/3000，卻具有和ELISA相當的靈敏度。蟲媒病毒和呼吸道病毒這兩類病毒不僅傳播廣泛、傳染性強、致病性強，其導致的臨床癥狀相似，往往難以鑒別診斷，病原體的快速準確檢出是采取正確治療方法和有效防制措施的基礎，本研究擬分別以6種蟲媒病毒和5種呼吸道病毒為檢測對象，以Arra

5、y-ELISA作為技術平臺，建立高特異性、高靈敏度和高通量的檢測方法。
　　方法:以乙型腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、登革病毒2型、登革病毒4型、東部馬腦炎病毒和辛德比斯病毒6種蟲媒病毒病毒，以及甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒5種呼吸道病毒為檢測對象，通過細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)待檢病毒，采用TCID50法對待檢病毒進行滴定，復蘇雜交瘤細胞制備單克隆抗體并純化，通過ELISA和IFA對單克隆抗體的特異性和靈敏度進行

6、初步鑒定，通過夾心ELISA優(yōu)化捕獲抗體和檢測抗體配對，對檢測抗體進行生物素標記，將捕獲抗體通過非接觸點樣點到96孔板每個微孔形成Array-ELISA陣列，優(yōu)化捕獲抗體和檢測抗體的濃度和反應條件，使用病毒培養(yǎng)物對檢測體系特異性和穩(wěn)定性進行驗證，使用梯度稀釋的病毒培養(yǎng)液對建立的Array-ELISA檢測方法進行靈敏度測定。
　　結果:1.通過腹水制備并純化獲得了針對6種腦炎病毒的9株單克隆抗體，對單克隆抗體的特異性和靈敏度進行了鑒

7、定并標記生物素，對捕獲抗體和檢測抗體配對進行了優(yōu)化，最終確定了4D5、2B5、2B8、4F9、1F1和4E11這6株分別針對乙型腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、登革病毒2型、登革病毒4型、辛德比斯病毒和東部馬腦炎病毒的單克隆抗體同時作為捕獲抗體和檢測抗體，捕獲抗體濃度分別為0.025mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.2mg/mL、0.05mg/mL、0.05mg/mL，檢測抗體濃度分別為0.002mg/mL、0.001m

8、g/mL、0.012mg/mL、0.002mg/mL、0.006mg/mL、0.008mg/mL時具有良好的特異性和靈敏度，以此條件建立Array-ELISA檢測方法對乙型腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、登革病毒2型、登革病毒4型、東部馬腦炎病毒和辛德比斯病毒的檢測靈敏度分別為3.1×103TCID50/mL、3.1×103TCID50/mL、3.1×103TCID50/mL、1.3×104TCID50/mL、1.3×104TCID50/mL和

9、2.5×104TCID50/mL;2.購買了針對5種呼吸道病毒的5對單克隆抗體分別作為捕獲抗體和檢測抗體，對這些單克隆抗體的特異性和靈敏度進行了鑒定，將檢測抗體標記生物素，對捕獲抗體和檢測抗體濃度進行了優(yōu)化，針對甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒3型的捕獲抗體A108、B12、8C5、8C4和C65467M的濃度分別為0.025mg/mL、0.1mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL和0.1mg/m

10、L，檢測抗體A245、B27、9C5、1E11和C65329M的濃度分別為0.005mg/mL、0.0014mg/mL、0.02mg/mL、0.02mg/mL和0.024mg/mL時具有良好的特異性和靈敏度，以此條件建立的Array-ELISA檢測方法對甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒3型的靈敏度分別為3.1×102TCID50/mL、1.3×103TCID50/mL、5×103TCID50/mL、2.5×