呼吸道病毒多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、呼吸道病毒是一組能夠通過(guò)呼吸道傳播引起呼吸系統(tǒng)或及其他系統(tǒng)疾病的病原微生物。呼吸道病毒傳染性強(qiáng),可以引起局部暴發(fā)和世界大范圍流行,嚴(yán)重影響人類健康。由于呼吸道致病微生物感染臨床癥狀相似,影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性,因此病原學(xué)證據(jù)在臨床診斷和流行病監(jiān)控中十分重要,但目前的檢測(cè)方法,如病毒分離、病毒抗原檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)等方法,尚不能滿足高效、快速和高通量的要求。季節(jié)性甲型流感病毒、乙型流感病毒、人鼻病毒及豬源H1N1流感病毒是致病性強(qiáng)和傳播速度快

2、的常見重要呼吸道病毒,亟需可以快速、準(zhǔn)確鑒別的檢測(cè)方法。
　　 目的:
　　 建立一種可同時(shí)檢測(cè)四種常見呼吸道病毒的多重RT-PCR快速檢測(cè)方法。
　　 方法:
　　 1、收集2009年9月至2009年10月在第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院以急性上呼吸道感染為主要表現(xiàn)的門診患者咽拭子標(biāo)本。
　　 提取病毒RNA,通過(guò)常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè),獲得上感病人常見感染呼吸道病毒病毒學(xué)證據(jù);
　　

3、2、使用pBS-TⅡ質(zhì)粒作為載體,構(gòu)建包含INFA、INFB、HRV和SOIVs四種病毒目的基因序列的重組子標(biāo)準(zhǔn)品;
　　 3、通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化,建立可同時(shí)檢測(cè)季節(jié)性甲型流感病毒(INFA)、乙型流感病毒(INFB)、人鼻病毒(HRV)和豬源H1N1流感病毒(SOIVs)的多重RT-PCR方法并評(píng)價(jià)其特異性和敏感性;
　　 4、應(yīng)用常規(guī)RT-PCR與多重RT-PCR方法同時(shí)對(duì)上感患者咽拭子進(jìn)行檢測(cè),比較兩種

4、方法的檢測(cè)效能。
　　 結(jié)果:
　　 1、在2009年9月至10月,共納入病例36例,其中男21例,女15例,年齡:24+10.08歲。在臨床診斷為急性上呼吸道感染的患者咽拭子樣本中檢測(cè)到四種呼吸道病毒(季節(jié)性甲型流感病毒、乙型流感病毒、人鼻病毒、豬源H1N1流感病毒),總例數(shù)為12例,其中季節(jié)性甲型流感病毒檢查陽(yáng)性3例,乙型流感病毒陽(yáng)性1例,人鼻病毒陽(yáng)性3例,豬源H1N1流感病毒陽(yáng)性5例。在流感病毒感染病例中,SOIV

5、s所占比例為55.6％。
　　 2、以pBS-TⅡ質(zhì)粒作為載體,構(gòu)建了包含INFA、INFB、HRV和SOIVs四種病毒目的基因序列的重組子,經(jīng)過(guò)定量鑒定和稀釋,制各了濃度為101-107 copies/ml的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品;
　　 3、建立了可同時(shí)檢測(cè)四種病毒的多重RT-PCR方法,該法可同時(shí)或分別擴(kuò)增INFA212bp、INFB489bp、HRV380bp和SOIVs153bp的基因片段。檢測(cè)的敏感性分別為104、104

6、、103、104copies/ml。采用相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,分別對(duì)其他6種常見呼吸道病原體(包括肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌核酸)進(jìn)行擴(kuò)增,均未檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物。
　　 4、常規(guī)RT-PCR與多重RT-PCR方法對(duì)臨床樣本的檢測(cè)陽(yáng)性一致率為83.3％,經(jīng)X2檢驗(yàn)兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)效能無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)進(jìn)行的吻合系數(shù)檢驗(yàn)提示兩種診斷方法吻合度較強(qiáng)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)