ROS敏感材料載SDF-1α納米粒趨化BMSCs歸巢、促進(jìn)創(chuàng)面血管化的研究.pdf

1、研究目的：
　　創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，其中有多種細(xì)胞、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子共同參與，通過多種細(xì)胞水平及分子水平的改變，重建皮膚的屏障功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，可參與皮膚重建過程中的血管化及上皮化過程。但是BMSCs的動(dòng)員、趨化、聚集，主要通過基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived facto

2、r1，SDF-1)的趨化作用實(shí)現(xiàn)。當(dāng)組織損傷或缺血、缺氧時(shí)，可誘導(dǎo)局部組織的SDF-1基因表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生的SDF-1可趨化、誘導(dǎo)BMSCs到損傷部位并歸巢，參與組織的局部血管化及創(chuàng)面修復(fù)。因此，局部形成高濃度SDF-1是誘導(dǎo)干細(xì)胞參與血管修復(fù)的必要條件。然而，如何在局部形成SDF-1的高濃度梯度是一個(gè)難題。直接局部血管內(nèi)注射SDF-1，會(huì)迅速被血液稀釋進(jìn)入全身循環(huán)而不能在局部形成有效濃度;而直接組織內(nèi)注射SDF-1，會(huì)分布不均勻，易降解

3、，且進(jìn)入循環(huán)的效率不確定。
　　將蛋白質(zhì)多肽類藥物通過可生物降解的微球系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)的快速降解，還可將藥物靶向輸送至體內(nèi)有效部位，達(dá)到定向釋放。在臨床治療中，病變部位發(fā)生的物理、化學(xué)或生物特性的改變，均能作為引起納米載體反應(yīng)的靶點(diǎn)?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是一種在生物體內(nèi)正常存在的物質(zhì)，但在多種疾病，如創(chuàng)傷或炎癥性疾病中，可在局部大量產(chǎn)生。因此活性氧為載藥納米粒的靶向釋放

4、提供新的靶點(diǎn)。
　　在本課題中，我們?cè)O(shè)想利用硫醇縮酮聚合物PPADT作為納米粒載體，制備出包載SDF-1且對(duì)ROS敏感的納米顆粒，通過靜脈給藥，使納米顆粒能在創(chuàng)面周圍組織局部釋放SDF-1，在創(chuàng)周局部形成了有效穩(wěn)定的SDF-1濃度梯度，從而促進(jìn)BMSCs向損傷局部趨化歸巢，促進(jìn)創(chuàng)周局部血管化，加快創(chuàng)面愈合。
　　研究方法:
　　1、載SDF-1α的ROS敏感納米粒(SDF-1α-PPADT)的構(gòu)建及體外鑒定
　　

5、(1)ROS敏感硫醇縮酮聚合物(PPADT)的合成
　　合成PPADT;通過生物核磁共振譜(1H-NMR，13C-NMR)和凝膠滲透色譜(GPC)驗(yàn)證其化學(xué)結(jié)構(gòu)與分子量，確證所獲得的PPADT化學(xué)結(jié)構(gòu)與預(yù)期相符。
　　(2)SDF-1α-PPADT納米粒的制備與性能鑒定
　　采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備SDF-1α-PPADT納米粒;通過透射電子顯微鏡(TEM)、粒徑分析儀觀測(cè)其表征;
　　(3)BCA法測(cè)納米粒中蛋白

6、含量，計(jì)算SDF-1α-PPADT納米粒的載藥量。
　　(4)CCK8法評(píng)價(jià)納米粒的細(xì)胞毒性試驗(yàn);
　　(5)SDF-1α-PPADT納米粒體外釋放實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)納米粒的ROS敏感釋放行為;
　　(6)Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)納米粒中SDF-1α的生物活性;
　　2、SDF-1α-PPADT納米粒對(duì)急性創(chuàng)面小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　(1)PPADT納米粒的體內(nèi)生物毒性評(píng)價(jià)
　　靜脈輸注納米粒后，觀察動(dòng)

7、物死亡率，血清酶學(xué)(CK、ALT、AST)，H&E染色觀察主要臟器病理學(xué)改變。
　　(2)評(píng)價(jià)SDF-1α-PPADT納米粒在動(dòng)物模型體內(nèi)的靶向釋放
　　(3)評(píng)價(jià)SDF-1α-PPADT納米粒對(duì)體內(nèi)SDF-1α的影響
　　(4)評(píng)價(jià)SDF-1α-PPADT納米粒對(duì)BMSCs的趨化和歸巢作用
　　通過外源性綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSCs，觀察SDF-1α-PPADT對(duì)BMSCs的局部趨化作用，激光共聚焦顯微鏡觀察創(chuàng)

8、周GFP+CD31+的細(xì)胞數(shù)量。
　　(5)評(píng)價(jià)SDF-1α-PPADT納米粒對(duì)創(chuàng)周血管化影響及創(chuàng)面愈合的影響
　　免疫組化觀察創(chuàng)周組織血管化程度(CD31)。動(dòng)態(tài)觀察創(chuàng)面愈合時(shí)間，記錄創(chuàng)面愈合率。
　　研究結(jié)果：
　　1、合成的活性氧敏感高分子材料PPADT分子量為11544Da，分散度為1.974，可作為納米粒的載體。通過復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備SDF-1α-PPADT納米粒，納米粒粒徑為124.7±27.47nm

9、，載藥率為1.8％，透射電子顯微鏡下觀察，納米顆粒呈球形，大小均勻，無粘連。
　　2、不同濃度PPADT納米粒與小鼠肺泡巨噬細(xì)胞RAW264.7共同培養(yǎng)24小時(shí)，通過CCK8法檢測(cè)各組PPADT納米粒對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率與對(duì)照組細(xì)胞無顯著差異(P＞0.05)，表明SDF-1α-PPADT納米粒對(duì)細(xì)胞增殖無明顯毒副作用。
　　3、將SDF-1α-PPADT納米粒分別暴露于PBS溶液（低ROS）與Fento

10、n試劑(高ROS)中釋放，1小時(shí)內(nèi)，在PBS溶液中SDF-1α-PPADT納米粒僅釋放出包裹的SDF-1α總量的23％，而在氧自由基存在的情況下釋放了32％;8小時(shí)內(nèi)，在PBS溶液中SDF-1α-PPADT納米粒釋放出包裹的SDF-1α總量的24％，而在Fenton試劑中釋放了60％;48小時(shí)內(nèi)，PBS溶液中SDF-1α僅釋放34％，F(xiàn)enton試劑中則基本釋放完全。
　　4、通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)納米粒中的SDF-1

11、α的活性，相同濃度的SDF-1α標(biāo)準(zhǔn)品與納米粒中SDF-1α對(duì)BMSCs細(xì)胞的趨化活性比為1∶0.73，這表明制備方式對(duì)SDF-1α蛋白的活性影響較小，納米粒釋放出的SDF-1α仍具有較強(qiáng)細(xì)胞趨化活性
　　5、不同濃度的SDF-1α-PPADT納米粒靜脈注入小鼠體內(nèi)，7天觀察期內(nèi)小鼠全部存活。病理切片觀察主要臟器，未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變或炎細(xì)胞浸潤(rùn)。CK，AST和ALT酶學(xué)指標(biāo)也未有明顯改變(P＞0.05)。動(dòng)物模型靜脈注射Cy5-S

12、DF-1α-PPADT納米粒6小時(shí)后，小動(dòng)物成像儀可見創(chuàng)周高熒光區(qū)域。全層皮膚缺損模型組給予SDF-1α-PPADT納米粒治療后，血清中SDF-1α水平及創(chuàng)周SDF-1α水平24小時(shí)內(nèi)均能穩(wěn)定維持在較高水平。全層皮膚缺損模型輸注SDF-1α-PPADT納米粒后，創(chuàng)周組織免疫組化可見血管化程度較對(duì)照組更高，CD31陽(yáng)性細(xì)胞更多。而同時(shí)輸注SDF-1α-PPADT和GFP-BMSCs3天后，創(chuàng)周冰凍切片可見SDF-1α-PPADT組較其它組

13、有更多GFP+CD31+的細(xì)胞。而且SDF-1α-PPADT組創(chuàng)面愈合較其他組更快。
　　研究結(jié)論：
　　1、成功合成了ROS敏感的高分子有機(jī)材料PPADT。通過復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，成功制備出符合粒徑要求、具有一定載藥量的SDF-1α-PPADT納米粒。
　　2、合成的SDF-1α-PPADT納米粒具有ROS敏感活性?？稍诟邼舛萊OS環(huán)境中釋放SDF-1α，且釋放出的SDF-1α仍保留有較強(qiáng)趨化活性。該納米粒對(duì)細(xì)胞增殖無明