神經(jīng)干細(xì)胞的分化影響其對SDF-1α的趨化性應(yīng)答.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)通過不斷分裂增殖以維持自身穩(wěn)定,并可分化成神經(jīng)系統(tǒng)中所有種類的神經(jīng)細(xì)胞,此外還具有高效遷移特性。在胚胎期的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中,NSCs自腦室側(cè)壁(lateral ventricle,LV)不斷遷移至特定區(qū)域形成具有特定功能組織,進(jìn)而構(gòu)建出復(fù)雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system,CNS),而NSCs的遷移缺陷則會導(dǎo)致許多神經(jīng)退行性疾病;存在于成年大腦側(cè)腦室外側(cè)

2、壁(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)區(qū)域中的NSCs可定向遷移至分子顆粒層和嗅球(olfactory bulb,OB)等神經(jīng)發(fā)生部位,參與神經(jīng)組織的形成;最近有研究報道,NSCs還可朝向病灶位點(diǎn)做趨化性遷移,NSCs的這一特性給治療神經(jīng)損傷性疾病帶來希望。因此,針對NSCs定向遷移機(jī)制的研究十分有必要。
　　 有研究報道,大腦損傷區(qū)域以及病灶位點(diǎn)分泌多種細(xì)胞生長因子

3、、趨化因子以及炎癥因子?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell-derived factor,SDF-1α)是研究最為廣泛的趨化因子之一,它通過與其專一性受體CXCR4結(jié)合,激活下游一系列信號通路。其中,PI3K/Akt和MAPKs信號通路參與調(diào)節(jié)SDF-1α誘導(dǎo)的NSCs的定向遷移。NSCs的遷移受到多種因素的綜合調(diào)節(jié),除了細(xì)胞外因子對其有促進(jìn)或抑制作用,在特定環(huán)境中,還受到細(xì)胞自身狀態(tài)的影響。有研究發(fā)現(xiàn),具有初步分化特征的神經(jīng)祖

4、細(xì)胞(neural progenitor cells,NPCs)展現(xiàn)出趨化性遷移能力,如:DCX或PSA-NCAM陽性的神經(jīng)元前體細(xì)胞和表達(dá)A2B5的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞,而未分化的NSCs(高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin)遷移能力相對低下,大部分停留在初始點(diǎn)。我們猜測處于特定分化階段的NSCs具有更強(qiáng)趨化性遷移能力。為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們選用了來源于小鼠小腦皮層的神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2,對其進(jìn)行分化誘導(dǎo)得到不同分化狀態(tài)的NSCs并進(jìn)行

5、表型鑒定;利用Boyden chamber和Dunn chamber趨化性遷移裝置檢測不同分化狀態(tài)的NSCs對SDF-1α的趨化性應(yīng)答差異;通過探測肌動蛋白微絲F-actin的組裝與聚合,對不同分化狀態(tài)的NSCs中細(xì)胞骨架的重組頻率和微絲的排列分布進(jìn)行比較;為了進(jìn)一步探索NSCs遷移與細(xì)胞分化狀態(tài)之問的關(guān)系,我們隨后在分子水平上研究與遷移分化相關(guān)聯(lián)的內(nèi)在機(jī)制。運(yùn)用Western blot技術(shù)對細(xì)胞內(nèi)涉及遷移的信號通路如PI3K/Akt和

6、MAPKs蛋白家族信號通路(ERK1/2、SAPK/JNK、p38MAPK信號通路)的激活水平進(jìn)行檢測,分析了在不同分化狀態(tài)NSCs中這些信號通路對SDF-1α刺激的應(yīng)答差異;最后,利用特異性抑制劑將上述信號通路分別阻斷,通過趨化性遷移實(shí)驗(yàn)檢測了不同分化狀態(tài)NSCs的遷移變化。
　　 綜合上述實(shí)驗(yàn),我們主要得到了以下結(jié)果:
　　 1.NSCs向SDF-1α的趨化性遷移能力受分化狀態(tài)的影響:在Boyden chamber趨

7、化遷移實(shí)驗(yàn)中,不同分化狀態(tài)的NSCs在5 ng/ml SDF-1α的誘導(dǎo)下,遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目不同,分化0.5天和1天的NSCs對SDF-1α應(yīng)答能力最強(qiáng);同時,分化0天、0.5天和1天的NSCs出現(xiàn)最大遷移數(shù)目的SDF-1α濃度為5 ng/ml,而分化3天NSCs對應(yīng)的最佳遷移濃度為50ng/ml,說明不同分化狀態(tài)的NSCs對SDF-1α敏感程度不同。
　　 2.特定分化階段的NSCs擁有較強(qiáng)細(xì)胞趨化性遷移能力。細(xì)胞的遷移速

8、度和遷移效率是構(gòu)成遷移的基礎(chǔ)要素,兩者相互獨(dú)立,受到不同信號通路的調(diào)控。在NSCs的不同分化狀態(tài)下,NSCs具有不同的運(yùn)動活性。分化0.5天和1天的NSCs隨機(jī)遷移速度比其他分化狀態(tài)的NSCs快。同時它們對SDF-1α的響應(yīng)能力也因分化狀態(tài)的不同而發(fā)生改變;在25 ng/ml SDF-1α濃度梯度中,分化1天的NSCs遷移方向性效率最高,并且具有最大遷移速度。
　　 3.SDF-1α刺激后,不同分化狀態(tài)的NSCs中微絲聚集以及細(xì)

9、胞骨架重組頻率不同。未分化的NSCs在5 ng/ml的SDF-1α處理30 min后細(xì)胞邊緣出現(xiàn)大量富含F(xiàn)-actin的片狀偽足,分化0.5天和分化1天NSCs中片狀偽足出現(xiàn)在5 ng/ml的SDF-1α刺激15 min左右,而分化3天的NSCs細(xì)胞邊緣在同樣刺激下未出現(xiàn)類似偽足結(jié)構(gòu)。
　　 4.不同分化狀態(tài)的NSCs中,PI3K/Akt和MAPKs信號通路對SDF-1α的應(yīng)答水平不同。在5 ng/ml的SDF-1α刺激不同時間

10、段(0、5、15、30、60 min)或不同濃度SDF-1α(0、5、25、50、100 ng/ml)處理30min后,在不同分化狀態(tài)NSCs中PI3K/Akt和MAPKs信號通路的激活狀態(tài)所對應(yīng)的SDF-1α濃度、SDF-1α刺激時間段以及活性持續(xù)時間均不相同。
　　 5.P13K/Akt和MAPKs對不同分化狀態(tài)的NSCs趨化性遷移發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用各不相同。已證明細(xì)胞的群體趨化性遷移、遷移速度和遷移效率都與細(xì)胞所處的分化狀態(tài)密