ROS敏感納米粒靶向釋放SDF-1α趨化BMSCs歸巢治療電燒傷血管損傷.pdf

1、研究背景:
　　電燒傷是現(xiàn)代工業(yè)社會特有的意外傷害，雖然發(fā)病率不高，但因其損傷是立體的，并具有夾心樣壞死和漸進性壞死的特點，造成局部組織損害嚴重，住院患者的截肢率超過30％，肢體往往遺留不同程度功能障礙，臨床危害性大。血管損傷所致的組織缺血缺氧性壞死是電燒傷組織漸進性壞死的重要原因。目前臨床上并無針對性的減輕血管損傷、促進血管修復的治療。如何促進電燒傷局部血管快速修復，對減輕組織壞死、改善預后具有重要意義。
　　骨髓間充質(zhì)干

2、細胞(BMSCs)具有向多種細胞分化的潛能。在燒創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下，BMSCs能從骨髓中迅速動員進入外周循環(huán)，在損傷局部歸巢并分化為內(nèi)皮祖細胞，進一步分化為血管內(nèi)皮細胞或直接分化為內(nèi)皮細胞參與血管損傷的修復。BMSCs的動員、趨化、聚集主要依賴于基質(zhì)細胞衍生因子-1α(SDF-1α)的趨化作用，而這種趨化作用依賴于局部高濃度的SDF-1α以及循環(huán)中的SDF-1α濃度梯度。因此，局部形成高濃度的SDF-1α以及循環(huán)中的SDF-1α濃度梯度是

3、趨化并捕捉干細胞參與血管修復的必要條件。
　　然而，如何在損傷局部形成高濃度的SDF-1α以及循環(huán)中的SDF-1α濃度梯度是一個難題。直接血管內(nèi)注射SDF-1α會迅速被血液稀釋進入全身循環(huán)而不能在損傷局部形成持久的有效濃度;直接組織內(nèi)注射SDF-1α分布不均勻，易降解，且進入循環(huán)的效率不確定。隨著藥物載體材料技術的發(fā)展，將SDF-1α通過可生物降解的納米粒系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止其在體內(nèi)快速降解，還可以將SDF-1α靶向輸送至體內(nèi)

4、有效部位，達到定向緩釋的目的。
　　實現(xiàn)納米粒藥物的靶向釋放，關鍵是確定病變部位特殊的物理、化學或生物學特性。活性氧(ROS)作為生物體內(nèi)病理性存在的致病因子，為納米粒藥物的靶向釋放提供了靶點。在我們的前期研究中，利用對ROS敏感的硫醇縮酮聚合物PPADT為納米粒載體，將SDF-1α蛋白包載其中，研制出了SDF-1α-PPADT納米粒，該納米粒可因病變組織內(nèi)高氧自由基濃度發(fā)生裂解而釋放藥物，從而達到靶向治療目的。本研究中，我們通過

5、制備大鼠電燒傷血管損傷模型，尾靜脈注射SDF-1α-PPADT納米粒，評價其通過靶向釋放SDF-1α、定向趨化BMSCs歸巢對電燒傷血管損傷修復的作用。
　　研究方法:
　　1、電燒傷血管損傷模型的制備
　　自制電燒傷設備，220V的電壓持續(xù)電擊大鼠6s。
　　2、電燒傷血管損傷的鑒定
　　傷后沿近心端方向切取電擊部位含主干血管肌肉的組織，假電燒傷組同樣部位取材，HE染色和CD31免疫組化染色觀察血管損傷情

6、況。
　　3、損傷局部組織ROS檢測
　　ROS熒光染色和ROS的RealTime PCR測定，觀察傷后局部ROS水平變化。
　　4、損傷局部組織SDF-1α含量測定
　　調(diào)節(jié)電擊時間的長短造成不同程度的組織損傷，ELISA測定局部SDF-1α水平變化。
　　5、SDF-1α-PPADT納米粒的制備
　　根據(jù)前期研究結果制備納米粒，先合成對ROS敏感的納米材料PPADT分子片段，然后通過復乳溶媒萃取法

7、制備包含SDF-1α蛋白的載藥納米粒。
　　6、ROS敏感的SDF-1α靶向釋放效應的驗證
　　傷后輸注SDF-1α-PPADT納米粒，分別從SDF-1α的在體分布和局部SDF-1α蛋白水平變化觀察納米粒體內(nèi)靶向釋放SDF-1α的情況。
　　7、BMSCs的定向趨化和歸巢效應驗證
　　傷后輸注SDF-1α-PPADT納米粒，同時輸注外源性的綠色熒光蛋白GFP標記的GFP-BMSCs，免疫熒光染色觀察GFP的分布，

8、驗證納米粒對BMSCs的定向趨化歸巢效應。
　　8、SDF-1α-PPADT納米粒對血管修復的作用
　　傷后輸注SDF-1α-PPADT納米粒，HE染色和CD31免疫組化染色觀察血管損傷修復情況。
　　研究結果:
　　1、電燒傷局部的大體觀察
　　電燒傷后所有大鼠均存活良好，電極板處形成Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，大鼠電擊后表現(xiàn)為雙后肢跛行。
　　2、電燒傷可致血管損傷
　　電燒傷大鼠血管內(nèi)皮細胞呈釘突樣凸向

9、管腔，連續(xù)性中斷，內(nèi)膜剝脫，管腔縮窄。
　　3、損傷局部ROS含量顯著升高
　　電燒傷大鼠血管損傷局部ROS綠色熒光分布明顯，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的mRNA表達水平增高。
　　4、一定范圍內(nèi)局部電燒傷程度與SDF-1α水平成反比
　　輕度電燒傷組織局部SDF-1α產(chǎn)生增多，但是隨著電燒傷損傷程度的加重，組織局部SDF-1α產(chǎn)生下降，電擊6s時損傷局部組織SDF-1α持續(xù)處于低水平狀態(tài)。
　　

10、5、SDF-1α-PPADT納米粒具有良好的靶向藥物釋放效應
　　輸注納米粒后，Cy5熒光顯示SDF-1α僅靶向分布于血管損傷局部，且損傷局部SDF-1α水平顯著提高。
　　6、SDF-1α-PPADT納米粒定向趨化BMSCs歸巢
　　輸注納米粒后第7天，可觀察到GFP-BMSCs陽性細胞在血管損傷局部明顯聚集。
　　7、SDF-1α-PPADT納米粒促進血管損傷修復
　　輸注納米粒后第10天，電燒傷大鼠血