電針調(diào)控PRG5-RhoA信號通路對MCAO大鼠eNSCs增殖與分化影響的研究.pdf

1、急性腦梗死(ACI)是導(dǎo)致病損嚴(yán)重、致殘率高和神經(jīng)功能恢復(fù)困難的重要原因。我們既往研究發(fā)現(xiàn)RhoA抑制信號通路參與ACI病變過程并阻遏內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(eNSCs)增殖與分化，電針百會、大椎穴可抑制RhoA信號跨膜傳導(dǎo)，減輕丘腦、黑質(zhì)、海馬繼發(fā)損害。但電針減輕ACI損害與PRG5調(diào)控RhoA抑制信號跨膜傳導(dǎo)、促進(jìn)神經(jīng)再生等關(guān)鍵問題不清楚。本課題建立大腦中動脈阻斷(MCAO)模型:①動態(tài)觀察電針對梗死灶神經(jīng)纖維、絲狀偽足和軸突生長及神經(jīng)修

2、復(fù)影響。②用shRNA介導(dǎo)沉默PRG5基因，檢測神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生部位海馬處BrdU/Nestin、BrdU/DCX、BrdU/NeuN、BrdU/GFAP的表達(dá)，明確PRG5抑制RhoA通路及電針作用。③檢測eNSCs分化相關(guān)RhoA信號通路蛋白，明確電針調(diào)控PRG5/RhoA促進(jìn)eNSCs分化機(jī)制;明確電針介導(dǎo)PRG5調(diào)控RhoA通路促進(jìn)eNSCs增殖為治療新靶點，為電針減輕ACI損害提供新的理論依據(jù)。
　　目的:
　　通過

3、觀察電針對大腦中動脈阻塞模型大鼠腦組織形態(tài)學(xué)、神經(jīng)功能缺損評分、海馬區(qū)eNSCs增殖與分化表達(dá)的影響，明確電針阻遏中樞神經(jīng)抑制信號傳導(dǎo)通路對海馬尤其是齒狀回部位eNSCs影響，探討電針對抗腦缺血損傷和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的分子機(jī)制，探討電針促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)和對抗腦缺血損傷的分子機(jī)制，為電針減輕ACI后神經(jīng)功能損害與促進(jìn)eNscs增殖、分化的研究提供新的分子靶標(biāo)，為指導(dǎo)臨床運(yùn)用電針治療腦梗塞提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　雄性健康SD

4、大鼠160只，鼠齡為10-12周齡，體重220-250g，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)3天后開始實驗。模型組(MCAO)分為腦缺血模型組和敲低PRG5腦缺血模型組(ShPRG5+MCAO)、電針組(EA)分為模型電針組和敲低PRG5電針組(ShPRG5+EA);每組30只，再分為1d、7d、14d三個時間點，每組每個時間點取10只行取材處理。隨機(jī)抽取6只大鼠采用免疫熒光法檢測各組大鼠梗死灶BrdU/Nestin（確定內(nèi)源性eNSCs標(biāo)記）、BrdU/D

5、CX（確定eNSCs增殖）、BrdU/NeuN（確定eNSCs分化為神經(jīng)元）、BrdU/GFAP（確定eNSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞）的表達(dá)情況;隨機(jī)抽取6只大鼠采用Western blot法檢測梗死灶PRG5、LPA、NogoA、RhoA蛋白的情況表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.大腦中動脈阻塞模型大鼠造模成功后，各組其神經(jīng)功能缺損評分在1d后最為明顯，隨著時間的延長其功能評分和癥狀逐漸改善。在行電針治療后，TTC染色結(jié)果提示，大

6、腦中動脈阻塞模型大鼠腦組織TTC染色顯示神經(jīng)功能缺損改變與梗死灶變化改變基本一致。MCAO大鼠造模成功的大鼠會明顯反應(yīng)遲鈍，體重減輕，進(jìn)食減少，精神差，嗜睡。向上提鼠尾時左前肢內(nèi)收，MCAO大鼠朝前爬行向左側(cè)傾倒或左側(cè)轉(zhuǎn)圈，甚至完全不能行走，意識水平下降，某些大鼠可出現(xiàn)左側(cè)霍納氏征等神經(jīng)功能缺損癥狀。少部分大鼠出現(xiàn)眼結(jié)膜、鼻粘膜分泌物增多，嚴(yán)重的出現(xiàn)抽搐或死亡。假手術(shù)組(Shame)在MCAO術(shù)后1d、7d、14d三個時間點神經(jīng)功能缺損

7、評分均為0分。造模成功后，MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分1d后達(dá)到高峰，隨后開始降低。電針治療組(EA)大鼠神經(jīng)功能缺損評分1d后神經(jīng)功能缺損評分最高，隨后開始降低，7d接近或稍高于正常水平。MCAO組與EA治療組大鼠在MCAO術(shù)后1d、7d、14d三個時間點比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;EA治療組、MCAO組與shame組在造模后1d、7d、14d三個時間點比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.尼氏染色結(jié)果顯示，

8、每高倍鏡視野(HP)下，Shame組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)異染色質(zhì)少;MCAO組大鼠海馬區(qū)出現(xiàn)尼氏小體顆粒減少或消失，出現(xiàn)大量的空泡，胞體腫脹;MCAO組錐體細(xì)胞層次不清、排列紊亂，神經(jīng)細(xì)胞腫脹、核仁不清，伴空泡變性，大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重皺縮深染。EA組海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核、核仁較MCAO組清晰，存活神經(jīng)元數(shù)目也多于MCAO組（P＜0.05）。
　　3.EA-7d組和MCAO-7d組損傷側(cè)海馬

9、處均出現(xiàn)紅色Brdu陽性細(xì)胞，主要集中在CA1、CA3、DG，Brdu陽性細(xì)胞呈卵圓形或圓形，成簇分布，著色深。Shame-7d組和MCAO-7d組損傷側(cè)海馬可見Brdu陽性細(xì)胞分散于海馬齒狀回，兩組數(shù)量無明顯差別(P＞0.05);EA-7d組和MCAO-7d組海馬處均可見Brud陽性細(xì)胞，但EA-7d組Brdu陽性細(xì)胞的數(shù)量較MCAO-7d組多，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);14天組中MCAO-14d組損傷側(cè)海馬Brdu陽性細(xì)胞較

10、shame-14d組明顯減少;EA-14d損傷側(cè)海馬的Brdu陽性細(xì)胞雖然較EA-7d有所減少，但明顯較MCAO-14多（P＞0.05）。本實驗第1d后，海馬梗死側(cè)DG區(qū)BrdU/Nestin雙標(biāo)陽性表達(dá)增加，7d時表達(dá)至高峰，且明顯高于shame組大鼠(P＞0.05);14d時陽性表達(dá)下降，但仍高于shame組(P＞0.05)。shame組齒狀回內(nèi)見少量BrdU/DCX+細(xì)胞。DCX免疫組化陽性細(xì)胞主要位于缺血DG區(qū)。EA組較MCAO

11、組7d、14d差異有顯著性意義（P＜0.05）。MCAO組大鼠腦梗死后第7d達(dá)到峰值;隨后陽性表達(dá)減弱，電針組大鼠BrdU/NeuN陽性表達(dá)均明顯高于MCAO組及shame組(P＞0.05)。與shame相比MCAO組和EA組海馬區(qū)GFAP免疫陽性細(xì)胞均較shame增多，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。EA組海馬區(qū)GFAP免疫陽性細(xì)胞較ShPRG5+EA組與EA組在術(shù)后1d即可見Brdu/nestin的陽性細(xì)胞表達(dá)升高，并逐漸

12、上升，在第7d處于最高值，隨后開始下降。ShPRG5+EA組與EA組大鼠在腦缺血后1d、7d、14d時間點比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05); EA組與shame組在腦缺血后1d、7d、14d時間點比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01); shame組、EA組、敲低PRG5后電針組均可見少量神經(jīng)元前體細(xì)胞，在腦缺血1d后即可增加，7d后細(xì)胞數(shù)逐漸減少，Sham組有少量表達(dá)。EA組與ShPRG5+EA組神經(jīng)元前體細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

13、＜0.05）。3個時間點電針組大鼠BrdU/NeuN陽性表達(dá)均明顯高于ShPRG5+EA組。EA組與ShPRG5+EA組在腦出血后1d即可見Brdu/GFAP表達(dá)升高，并逐漸上升，在第7d處于最高值，隨后開始下降，第14d后ShPRG5+EA組仍高于同期各組。EA組與ShPRG5+EA組大鼠在腦缺血后第7d、14d后比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05);與假手術(shù)組相比，在腦缺血后1d、7d比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與EA組相比

14、，ShPRG5+EA組在腦缺血后1d、7d、14d三個時間點均升高。
　　4.與shame組比較，敲低PRG5組大鼠各時間點PRG5 mRNA的表達(dá)顯著減少，說明敲低后可使MCAO大鼠腦內(nèi)PRG5mRNA的表達(dá)下調(diào)。與敲低MCAO組比較，EA組各時間點PRG5 mRNA的表達(dá)增加(P＜0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明電針后可使PRG5 mRNA的表達(dá)上調(diào)。:與shame組相比，7d和14dMCAO組大鼠RhoA蛋白的表達(dá)顯著增加（

15、P＜0.05），說明腦缺血后可促進(jìn)大鼠RhoA蛋白的表達(dá)，與MCAO組比較，EA組RhoA蛋白的表達(dá)減少，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），電針可使RhoA蛋白的表達(dá)下調(diào)。與MCAO組比較，ShPRG5+MCAO組的RhoA蛋白的表達(dá)各時間點上調(diào)明顯，具有顯著性差異（P＜0.05）;與ShPRG5+M組相比，ShPRG5+EA組RhoA蛋白表達(dá)增加，具有顯著性差異（P＜0.05）。MCAO組中7d和14d大鼠海馬RhoA蛋白表達(dá)與Sham

16、e組相比均顯著上升（P＜0.05）。在MCAO術(shù)后7d和14d中，各電針干預(yù)組表達(dá)較MCAO組降低（P＜0.05），其中敲低PRG5組的RhoA蛋白表達(dá)較未敲低組相比各時間點均升高，有顯著差異(P＜0.05)，同時與敲低PRG5組后電針干預(yù)組相比各時間點均升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與shame組相比，MCAO組大鼠NogoA蛋白的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），說明造模后可促進(jìn)模型大鼠腦內(nèi)NogoA蛋白的表達(dá)，電針可使NogoA

17、蛋白的表達(dá)下調(diào)。與MCAO組比，各時間點EA組的NogoA蛋白的表達(dá)減少（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。與MCAO組比較，ShPRG5+M組的NogoA蛋白的表達(dá)各時間點上調(diào)明顯，具有顯著性差異（P＜0.05）;與EA組相比，ShPRG5+EA組NogoA蛋白表達(dá)增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。MCAO組與shame組3個時間點比較，海馬部位的LPA蛋白表達(dá)均有所升高(P＜0.05);EA組與shame組比較，海馬部位的LPA蛋

18、白表達(dá)1d后開始升高，7d達(dá)到峰值，14d蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)，與MCAO組比較，ShPRG5+M組海馬部位LPA蛋白的表達(dá)有所升高，海馬部位的LPA蛋白表達(dá)量明顯上升（P＜0.05），與（P＜0.05）;與ShPRG5+EA組相比較，EA組海馬部位的LPA蛋白表達(dá)量略有降低，敲低PRG5后LPA蛋白表達(dá)上升，具有顯著性差異（P＜0.05）。Shame組三個時間點之間無顯著性差異(P＞0.05);MCAO組中1d組與7d組、14

19、d與7d組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而14d組與1d組之間的差異不明顯(P＞0.05);與shame組相比，同時間點未敲低各組均明顯高于同時段的shame組(p＜0.05)。EA組中1d組與7d、14d組之間均有顯著差異(P＜0.05)，而7d組與14d組之間的差異不顯著均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與shame組相比，1d組與14d組差異不顯著（P＞0.05），其余未敲低1d組、7d組、14d組均高于同時間點的shame組

20、（P＜0.05）;與MCAO組相比較，1d后EA組與MCAO組之間差異不顯著（P＞0.05），7d組的EA組與MCAO組之間的差異顯著(P＜0.05)。ShPRG5+M組中d組與7d組、14d組之間無顯著的差異(P＞0.05)。與shame組相比較，1d組、7d組、14d組各均低于同時相的shame組（P＜0.05）;與MCAO組相比，3個時間點的組別之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與EA組相比較，各時間點組別之間均有顯著的差

21、異（P＜0.05）。ShPRGS+EA組中1d組與7d組之間有顯著的差異（P＜0.05）。與shame組相比，7d組、14d組均高于同時相下的shame組（P＜0.05）;與MCAO組相比，1d組之間有顯著的差異（P＜0.05），其余2個時間點與MCAO組的比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與EA組相比較，3個時間點的組別之間的有顯著的差異（P＜0.05）;與ShPRG5+M組相比，1d組與7d組之間有顯著的差異（P＜0.05），1d組

22、與14d組的比較均無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.電針可改善MCAO大鼠神經(jīng)功能及腦梗死體積比，可能與抑制RhoA信號通路、促進(jìn)eNSCs增殖與分化有關(guān)。
　　2.電針對梗死灶通路蛋白Nestin（確定內(nèi)源性eNSCs標(biāo)記）、BrdU/DCX（確定eNSCs增殖）、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP（（確定eNSCs分化）陽性細(xì)胞數(shù)增加，電針可促進(jìn)MCAO大鼠海馬部位eNSCs增殖、分化。