基于MicroRNa-9-Notch1信號(hào)通路探討電針對(duì)MCAO大鼠內(nèi)源性NSCs增殖的影響.pdf

1、目的：
　　探討電針“曲池”、“足三里”穴是否通過(guò)microRNA-9(miR-9)調(diào)控Notchl信號(hào)通路促進(jìn)缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injury，IRI）大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(Endogenous neural stem cells，NSCs)增殖的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　1.將SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組，模型(MCAO)組，電針(MCAO+EA

2、)組，電針+DMSO溶劑(EA+DMSO)組和電針+miR-9 mimics(EA+miR-9mimics)組。
　　2.參照Z(yǔ)ea Longa法，制備大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)模型。鑒定MCAO模型成功后，手術(shù)第二天開始實(shí)施電針干預(yù)治療，取患側(cè)“曲池”、“足三里”組穴，應(yīng)用G6805電針治療儀，針刺電壓峰值為6V，疏密波，頻率1～20Hz，以肢體輕輕抖動(dòng)

3、為度，每次電針30min，1次/天，共7天。假手術(shù)組及模型組，不予任何治療。
　　3.將Brdu溶于無(wú)菌生理鹽水中，造模后分別在第2、3、4、5、6天進(jìn)行腹腔注射，2次/天，每次注射間隔8h; DMSO、miR-9 mimics采用腦立體定位儀進(jìn)行側(cè)腦室注射，造模前30min完成。
　　4.采用Zea-Longa評(píng)價(jià)法評(píng)估各組神經(jīng)功能缺損情況;TTC染色計(jì)算腦梗死體積;利用Catwalk XT10.0步態(tài)分析系統(tǒng)觀察大鼠運(yùn)動(dòng)

4、功能;免疫組化觀察腦缺血皮質(zhì)區(qū)Ki-67、Nestin、Vimentin和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的增殖情況;免疫熒光觀察Brdu分別與Nestin和GFAP，以及Nestin與GFAP共定位情況;Westem blotting法檢測(cè)腦缺血皮質(zhì)區(qū)中細(xì)胞周期限制點(diǎn)調(diào)控因子P16、Cyclin D1、CDK4的表達(dá)水平和Rb磷酸化水平，以及Notchl信號(hào)通路信號(hào)分子Notch1、JAG1、NICD、Hes1、Hes5的蛋白水平;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

5、檢測(cè)腦缺血皮質(zhì)區(qū)中miR-9相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)電針“曲池”、“足三里”穴治療MCAO大鼠7天，有效減輕大鼠神經(jīng)功能缺損(p＜0.05)和減少腦梗死體積(p＜0.05)。
　　2.電針“曲池”、“足三里”穴提高M(jìn)CAO大鼠在Catwalk系統(tǒng)通道的運(yùn)動(dòng)速度(p＜0.05)，
　　3.減少持續(xù)時(shí)間(p＜0.05);其MCAO大鼠的步長(zhǎng)、爪印面積、最大接觸面積、最大壓強(qiáng)和平均壓強(qiáng)（右前肢、右后

6、肢、左后肢）增加、四肢擺動(dòng)時(shí)間縮短(p＜0.05)，而四爪單腳站立時(shí)間無(wú)顯著性差異(p＞0.05);肢體著地支撐模式發(fā)生變化（以AB步態(tài)模式為主），使身體維持協(xié)調(diào)平衡。
　　4.電針“曲池”、“足三里”穴治療缺血再灌注損傷大鼠7天后，促進(jìn)皮質(zhì)Ki-67(+)、Nestin(+)細(xì)胞、Vimentin(+)細(xì)胞及GFAP(+)細(xì)胞數(shù)量均增加(p＜0.01); Brdu分別與Nestin、GFAP共定位觀察，發(fā)現(xiàn)Brdu(+)/Nes

7、tin(+)、Brdu(+)/GFAP(+)共定位細(xì)胞數(shù)量在皮質(zhì)區(qū)增加;并且Nestin(+)與GFAP(+)共定位細(xì)胞主要在缺血周圍區(qū)其數(shù)量大量增殖，而遠(yuǎn)隔區(qū)的皮質(zhì)部位也出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。
　　5.電針“曲池”、“足三里”穴治療缺血再灌注損傷大鼠7天后，電針(MCAO+EA)組CyclinD1、CDK4的蛋白水平和p-Rb的磷酸化水平較模型(MCAO)組升高(p＜0.05)，而P16的表達(dá)水平降低(p＜0.05)。
　　6.以

8、U6 snRNA作為內(nèi)參，miR-9在各組大鼠缺血周圍區(qū)的皮質(zhì)腦組織相對(duì)假手術(shù)(Sham)組的表達(dá)，其中模型組、電針組和電針+miR-9激動(dòng)劑組其表達(dá)水平均顯著性下降（P＜0.05），而電針干預(yù)7天后，miR-9的表達(dá)水平較模型組進(jìn)一步降低(P＜0.05)，而與電針+miR-9激動(dòng)劑(EA+miR-9 mimics)組無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　7.電針+miR-9激動(dòng)劑(EA+miiR-9 mimics)組相對(duì)電針+DMS

9、O溶劑(EA+DMSO)組Brdu(+)細(xì)胞數(shù)量、Nestin(+)細(xì)胞數(shù)量以及Brdu與Nestin共定位的細(xì)胞數(shù)量減少。
　　8.與假手術(shù)（Sham）組相比，模型(MCAO)組、電針(MCAO+EA)組和電針+DMSO溶劑(EA+DMSO)組大鼠腦缺血周圍區(qū)的皮質(zhì)部位Notch1、JAG1、NICD、Hes1、Hes5的蛋白表達(dá)量顯著性增加（p＜0.05或p＜0.01）;與模型(MCAO)組相比，電針(MCAO+EA)組和電針

10、+DMSO溶劑(EA+DMSO)組大鼠腦缺血周圍皮質(zhì)區(qū)Notch1、JAG1、Hes1、Hes5的蛋白表達(dá)量進(jìn)一步增加（p＜0.05或p＜0.01），而NICD蛋白表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，但有增加趨勢(shì);與電針+DMSO溶劑(EA+DMSO)組相比，電針+miR-9激動(dòng)劑(EA+miR-9 mimics)組大鼠腦缺血周圍皮質(zhì)區(qū)Notch1、NICD、Hes1、Hes5的蛋白表達(dá)量明顯降低(p＜0.05)，而JAG1蛋白表達(dá)沒有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.基于“治痿病獨(dú)取陽(yáng)明”中醫(yī)理論證實(shí)電針“曲池”、“足三里”穴治療缺血再灌注損傷大鼠7天，能夠改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死體積。進(jìn)一步采用Catwalk步態(tài)系統(tǒng)分析，揭示電針“曲池”、“足三里”穴能有效改善缺血性腦卒中大鼠的運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)功能。2.電針“曲池”、“足三里”穴促進(jìn)缺血性腦卒中大鼠缺血周圍區(qū)反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖，以及遠(yuǎn)隔區(qū)的皮質(zhì)部位神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并分化為GFAP(

12、+)星型膠質(zhì)細(xì)胞，但也可能來(lái)源于其他部位NSCs的遷移、分化。其Brdu(+)/Nestin(+)和Brdu(+)/GFAP(+)細(xì)胞增殖與皮質(zhì)P16-Cyclin D1/CDK4復(fù)合物-Rb調(diào)控細(xì)胞周期限制點(diǎn)由G0/G1期向S期切換密切相關(guān)。
　　3.電針“曲池”、“足三里”穴抑制MCAO大鼠缺血周圍區(qū)的皮質(zhì)部位miR-9的表達(dá)，激活Notch1信號(hào)通路（與配體JAG1無(wú)關(guān)），活化NICD促進(jìn)下游Hes1和Hes5的表達(dá)，從而促