Wnt3a-LRP5信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)ST2細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、骨骼的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同作用的結(jié)果。如果成骨細(xì)胞骨形成作用和破骨細(xì)胞骨吸收作用之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，就會(huì)發(fā)生骨密度和骨結(jié)構(gòu)異常，表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松癥等疾病。研究表明，骨密度與骨代謝調(diào)節(jié)明顯受遺傳因素影響。編碼低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein5,LRP5)的基因-LRP5近年來(lái)研究最多的控制骨密度的基因之一。 LRP5的功能喪失

2、性突變導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，而功能獲得性突變導(dǎo)致高骨密度癥(highbonemass，HBM)。LRP5是一種單次跨膜的細(xì)胞膜表面蛋白，它作為Wnt蛋白的共受體參與經(jīng)典的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路，由此可見(jiàn)經(jīng)典的Wnt/LRP5信號(hào)傳導(dǎo)通路在骨形成過(guò)程中具有重要作用。LRP5在骨膜內(nèi)及骨小梁表面的成骨細(xì)胞表面表達(dá)，而不在破骨細(xì)胞中表達(dá)。已有的研究結(jié)果提示LRP5基因影響骨密度是通過(guò)影響成骨細(xì)胞的功能而發(fā)生的。具有骨形成作用的成骨細(xì)胞是由間充質(zhì)干細(xì)胞(

3、mesenchymalstemcells，MSCs)分化而來(lái)的。因此，我們推測(cè)經(jīng)典的Wnt/LRP5信號(hào)傳導(dǎo)通路可能從增殖和/或分化兩方面影響間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而影響骨質(zhì)的形成。 為了分析經(jīng)典的Wnt/LRP5信號(hào)傳導(dǎo)通路在間質(zhì)成骨中的具體作用機(jī)制，本研究選擇Wnt3a作為經(jīng)典Wnt蛋白家族的代表和ST2細(xì)胞株作為間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)完成體外實(shí)驗(yàn)。外源性Wnt3a的獲得是通過(guò)收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3acDNA的L-cell細(xì)

4、胞株的培養(yǎng)基作為條件培養(yǎng)基(conditionedmedia，CM)而實(shí)現(xiàn)的。ST2細(xì)胞株是從BC8小鼠骨髓中分離出來(lái)的一種間質(zhì)細(xì)胞株，它具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)，擁有多種分化潛能，在特定的體內(nèi)外微環(huán)境條件下，它可以分化為成骨細(xì)胞。堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性升高是間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的一個(gè)重要標(biāo)志。 本研究采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式，將野生型、兩種功能喪失突變型和功能獲得突變型LRP5表達(dá)載

5、體轉(zhuǎn)染于ST2細(xì)胞，使其在ST2細(xì)胞中得以表達(dá)并發(fā)揮生物作用。利用RT-PCR、WesternBlotting和細(xì)胞免疫熒光的方法檢測(cè)ST2細(xì)胞中LRP5及不同LRP5表達(dá)載體的表達(dá)情況；將外源性Wnt3a和野生型或不同突變型LRP5同時(shí)作用于ST2細(xì)胞，利用BrdU摻入法檢測(cè)Wnt3a/LRP5信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞增殖的影響；在L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及無(wú)定向誘導(dǎo)分化條件下，分別檢測(cè)Wnt3a/LRP5信

6、號(hào)傳導(dǎo)通路和外源性Wnt3a對(duì)細(xì)胞ALP活性的影響；分析Wnt3a/LRP5信號(hào)傳導(dǎo)通路是在細(xì)胞增殖還是分化或增殖和分化方面對(duì)ST2細(xì)胞產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Wnt3a/LRP5信號(hào)傳導(dǎo)通路在ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用。Wnt3a對(duì)ST2細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用。在定向誘導(dǎo)ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，Wnt3a促進(jìn)細(xì)胞分化的作用更顯著。 分析Wnt3a/LRP5信號(hào)傳導(dǎo)通路在間充質(zhì)干細(xì)胞向成